Приказ 9 апреля 1990 г. N 141 о дальнейшем совершенствовании мероприятий по профилактике клещевого энцефалита в целях упорядочения и усиления мероприятий по профилактике заболеваний людей клещевым энцефалитом утверждаю

Скачать 0.62 Mb.

Название	Приказ 9 апреля 1990 г. N 141 о дальнейшем совершенствовании мероприятий по профилактике клещевого энцефалита в целях упорядочения и усиления мероприятий по профилактике заболеваний людей клещевым энцефалитом утверждаю
страница	4/5
Тип	Документы

rykovodstvo.ru > Руководство эксплуатация > Документы

1 2 3 4 5

Регистрация больных профессиональным заболеванием клещевым энцефалитом в санитарно - эпидемиологических станциях ведется в "Журнале учета профессиональных заболеваний" (ф. N 363/у-86), а в лечебно - профилактических учреждениях в "Журнале учета инфекционных заболеваний" (ф. N 060/у).

Начальник Управления
специализированной медицинской помощи
Министерства здравоохранения СССР
А.Н.ДЕМЕНКОВ

Начальник Главного
эпидемиологического управления
Министерства здравоохранения СССР
М.И.НАРКЕВИЧ

Приложение N 2
к приказу Минздрава СССР
от 9 апреля 1990 г. N 141

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
ПО ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА

Методические указания разработаны Институтом полиомиелита и вирусных энцефалитов АМН СССР при участии Омского научно - исследовательского института природноочаговых инфекций Минздрава РСФСР.
Методические указания разрешается размножить в необходимом количестве экземпляров.

При заболевании человека более всего поражается нервная ткань, хотя наблюдаются поражения и других органов: печени, сердца, почек, селезенки, лимфатических узлов. Период циркуляции вируса в крови больного непродолжителен, обычно не превышает времени лихорадочного состояния. Вирус обнаруживают в первые дни лихорадки (3-5-й день) в крови, в спинномозговой жидкости, в мозгу умерших. Исчезновение вируса из крови происходит в процессе активации неспецифических и специфических элементов иммунной системы.
Тип иммунного ответа формируется в первые дни после контакта вирусного антигена с клетками иммунной системы, зависит от генетически обусловленной чувствительности организма и вирулентности штамма возбудителя. Иммунный ответ направлен не только против свободного вируса, но и против зараженных клеток, распознавание и разрушение которых до сборки в них инфекционных вирионов играет важную роль в выздоровлении. Лимфоциты, которым принадлежит ведущая роль в формировании специфического иммунитета, сенсибилизируются антигенами вируса. Степень сенсибилизации имеет прямую связь с последующим развитием патологического процесса и формой инфекции.
В крови заболевших КЭ <*> появляются специфические антитела: первыми - иммуноглобулины класса М, которые затем постепенно заменяются иммуноглобулинами класса G. Тормозящие гемагглютинацию антитела нередко обнаруживают уже в первые дни заболевания. Их титр может достигать наивысшего уровня на II-III неделе от начала заболевания. В части случаев (до 30-40%) высокую их концентрацию определяют уже на 1 неделе. В отдельных случаях (1-3%) формирование антител настолько замедлено, что их выявляют лишь на VI-VII неделе в невысоком титре. Комплементсвязывающие антитела появляются несколько позже. В большинстве случаев на 1 неделе от начала заболевания они либо отсутствуют, либо их концентрация невелика. Однако у части больных (до 15%) высокий титр антител этого вида обнаруживают даже на 1 неделе. Наивысшие показатели накопления комплементсвязывающих антител обычно определяют на VI-IX неделях от начала болезни. В некоторой части случаев (до 60%) эти антитела отсутствуют вплоть до IV-V недели, вследствие замедленного их формирования. Вируснейтрализующие антитела обычно появляются в конце I - начале II недели. Титр их повышается на протяжении 3-4 недель и затем сохраняется без изменения в течение многих лет жизни переболевшего. Тормозящие гемагглютинацию антитела обычно присутствуют в крови реконвалесцентов несколько лет, их титр снижается постепенно, но иногда резко падает уже в стадии ранней реконвалесценции. Комплементсвязывающие антитела сохраняются в крови переболевших не так долго: уже через год после болезни у 40% реконвалесцентов их титр может снижаться до неопределяемого, у остальных они могут быть выявлены в течение разного срока вплоть до 7 лет. При определении антител иммуноферментным методом (ИФМ) специфические антитела обнаруживают несколько раньше, чем подавляющие гемагглютинацию, и в более высоких разведениях сывороток. Наивысшую концентрацию антител чаще всего выявляют на II-III неделе от начала заболевания. При быстром формировании иммунитета высокие показатели ИФМ можно получить уже в начале заболевания. В случаях замедленной продукции антител в иммуноферментном тесте можно выявить антитела при отрицательных показателях РТГА.
--------------------------------
<*> Список сокращений см. стр. 45

В некоторой части случаев заболевание КЭ наблюдается у лиц вакцинированных и естественно иммунизированных. Известны единичные случаи повторного заболевания КЭ. Недостаточная для полного предотвращения заболевания напряженность иммунитета может быть обусловлена свойствами вирусного штамма, количеством вируса, попавшего в организм, временным ослаблением резистентности организма или совокупностью этих факторов. Заболевания на фоне грундиммунитета, как правило, протекают в более легкой форме, специфические антитела выявляются уже в первые дни заболевания.
При диагностике КЭ оптимальным является выделение вируса от больного в острой стадии заболевания (вирусологическое обследование больного) и обнаружение нарастания титра специфических антител (серологическое исследование парных проб крови).

Материалы
для вирусологического и серологического обследования.
Сбор, транспортировка, хранение

Серологическими методами исследуют парные сыворотки крови: I пробу крови, взятую на I-II день обращения за медицинской помощью, до начала лечения специфическими сывороточными препаратами, II пробу - на III-IV неделе от начала заболевания. В случае отсутствия антител может быть проведено исследование III пробы крови, взятой по указанию лечащего врача через полтора - два месяца от начала болезни.
Вирусологическому исследованию подлежит 1 сыворотка (или плазма) крови или 10% суспензия сгустка крови в физиологическом растворе, а также спинномозговая жидкость, взятая с терапевтической целью. В случае летального исхода исследуют суспензии мозговой ткани, взятой из различных отделов головного, а также шейного и грудного отделов спинного мозга.
Кровь забирают из вены шприцем в количестве не менее 5 мл и переносят в стерильную пробирку. Для образования сгустка и лучшей его ретракции кровь выдерживают 30 минут при +37 град. С или 1-2 часа при комнатной температуре. Для получения плазмы в пробирку предварительно вносят гепарин из расчета 10 МЕ на 1 мл крови. Пробу направляют в лабораторию в термосе со льдом. Если это невозможно сделать в тот же день, то пробирку оставляют в холодильнике при температуре +4 град. С и отправляют в лабораторию через сутки. В лечебных учреждениях, находящихся в отдаленных от лаборатории районах, сыворотку крови необходимо отделить от сгустка и эритроцитов в тот же день, не допуская бактериального загрязнения, и хранить до отправления при температуре +4 град.С в плотно закрытых флаконах или пробирках.
В лаборатории сыворотку отсасывают стерильной пастеровской пипеткой и хранят в запаянных ампулах или флаконах с резиновыми пробками. При получении проб сывороток или плазмы, предназначенных для серологического обследования, нельзя допускать лизиса эритроцитов крови. Для этого перед розливом в ампулы или флаконы сыворотку (плазму) тщательно очищают от примеси эритроцитов с помощью центрифугирования или отстаивания при +4 град.С.
Материалы, предназначенные для первичного выделения или реизоляции вируса, желательно хранить до момента обследования в холодильниках при -60 град. С, контейнерах с сухим льдом (СО2) или в жидком азоте. Менее приемлем для этих целей режим хранения при -20 град. С. Пробы сывороток, плазмы, спинномозговой жидкости перед обследованием на антитела в серологических реакциях можно сохранять длительное время (несколько месяцев) при +4 град. С или при отрицательной температуре. Надо иметь в виду, что в результате многократного замораживания и оттаивания материалов происходит снижение титров вируса и антител, что приводит к искажению данных обследования.
На каждую пробу, направляемую в лабораторию для серологического обследования, заполняется "Направление на анализ" (уч. ф. N 200/у) с указанием номера пробы (I, II).
Лаборатория должна обеспечить правильное хранение первых проб, пока будут собраны последующие. На ампулы с сывороткой или флаконы (емкостью 5 мл) с резиновыми пробками наклеивают этикетки с указанием лабораторного номера регистрации или очередности взятия пробы (I, II, III). Регистрацию материала, поступившего на анализ, производят в "Журнале регистрации серологических исследований" (уч. ф. N 259/у). Лабораториям областных СЭС целесообразно распределить записи следующим образом: отвести несколько страниц для каждого административного района, а больных областного города записывать в алфавитном порядке, отведя несколько страниц для каждой начальной буквы. Такая форма записи значительно упрощает регистрацию повторно поступившего материала.
Работа по сбору, хранению, транспортировке и вирусологическому обследованию материалов от больных КЭ и из природных очагов проводится при строгом соблюдении режима, обеспечивающего безопасность персонала (см. "Положение о порядке учета, хранения, обращения, отпуска и пересылки культур бактерий, вирусов, риккетсий, грибков, простейших, микоплазм, бактерийных токсинов, ядов биологического происхождения", Минздрав СССР, 1980г., а также "Инструкцию о противоэпидемическом режиме работы с материалом, зараженным или подозрительным на зараженность возбудителями инфекционного заболевания I-II групп", Минздрав СССР, 1979 г.).

Серологическая диагностика

Реакция торможения гемагглютинации (РТГА)

РТГА выполняют в соответствии с наставлением по постановке этой реакции, прилагаемым к набору ингредиентов для РТГА, который выпускает предприятие - изготовитель. В качестве дополнения к этому наставлению необходимо принимать во внимание следующее.
1. Эритроциты от разных гусей, используемые для РТГА, нельзя смешивать, так как смесь может давать неспецифическую агглютинацию. Рабочую взвесь эритроцитов готовят перед самым употреблением. Результаты РГА и РТГА учитывают следующим образом. Равномерный тонкий слой эритроцитов, выстилающий дно лунки по всей кривизне, оценивают как полную гемагглютинацию (при оценке по системе "четырех крестов" ++++). В случае образования эритроцитами кольца на менее однородном или более тонком слое осадка регистрируют частичную гемагглютинацию (+++ или ++). Минимальная гемагглютинация - осадок в виде пуговки на тонком или фрагментированном слое эритроцитов (+ или +/-). При полном отсутствии гемагглютинации осадок имеет форму компактной пуговки без признаков окружающего тонкого слоя эритроцитов (-). Результаты ++++, +++ и ++ расценивают как свидетельство наличия достаточного количества антигена в данной лунке (положительная реакция в РГА, отрицательная реакция в РТГА). Результаты +, +/- и - расцениваются как отрицательная реакция в РГА или положительная в РТГА.
2. В РТГА антиген используют в объеме 0,2 мл или 0,025 (микротитратор Такачи) вместо 0,4 мл или 0,05 мл (микротитратор Такачи), употребляемых при титровании антигена в РГА. Поэтому, чтобы определить разведение антигена, содержащее 4 единицы, для использования в РТГА отсчитывают от конечной точки титрования антигена не 3, а 4 разведения, а для рабочего разведения, содержащего 8 единиц - 5 разведений. Так, при титре антигена в РГА 1:320 4 АЕ содержится в разведении 1:40, 8 АЕ - в разведении 1:20.
3. При выполнении РТГА в объеме 0,8 мл рабочее разведение антигена должно содержать 8 единиц в 0,2 мл, при общем объеме 0,1 мл (микротитратор Такачи) - работают с 4 единицами антигена в 0,025 мл, так как титр антигена при работе с малыми объемами в 2 раза уменьшается.
4. Неспецифические ингибиторы гемагглютинации, обычно содержащиеся в сыворотках, не адсорбируются на каолин, если проба сильно гемолизирована, контаминирована бактериями и длительное время хранилась при +4 град. С. В таких случаях для удаления ингибиторов используют экстрагирование ацетоном. Для этого 1 объем сыворотки (0,1 мл) разводят физиологическим раствором в 10 раз (0,9 мл), охлаждают на льду и добавляют 12 объемов (по отношению к разведенной сыворотке) холодного ацетона (12 мл). После экстрагирования в течение 5 минут смесь центрифугируют 5 минут при 2500 об/мин, и +4 град. С. Надосадочную жидкость осторожно (не взболтать осадок!) удаляют. Осадок ресуспендируют в прежнем объеме (12 мл) охлажденного ацетона, энергично встряхивают, экстрагируют 1 час, выдерживая на льду, периодически встряхивая, центрифугируют. Надосадочную жидкость удаляют. Осадок высушивают под вакуумом при комнатной температуре или струей воздуха, создаваемой вентилятором. Процедуру испарения ацетона в последнем случае следует проводить в вытяжном шкафу или хорошо проветриваемом помещении. Высушенный осадок разводят буферным раствором рН 9,0 из набора для гемагглютинации так, чтобы получить разведение сыворотки 1:10 (в 1 мл). Растворение осадка заканчивается в течение нескольких часов при комнатной температуре (при периодическом встряхивании) или в течение ночи в рефрижераторе.
Через 8-10 месяцев хранения сывороток при +4 град. С неспецифические ингибиторы не удается удалить из гемолизированных и контаминированных бактериями проб даже обработкой ацетоном. Кроме того, энзиматическая деятельность бактерий может приводить к полному разрушению специфических антител в сыворотке.
5. Обработка 25% взвесью каолина частично или полностью удаляет из сыворотки иммуноглобулины класса М, или ранние специфические антитела, тогда как экстрагирование ацетоном - более щадящий метод обработки. Тем не менее метод удаления неспецифических ингибиторов каолином рекомендуют для использования, как более простой, а изменение напряженности гуморального иммунитета при заболевании выявляют по изменению титра специфических иммуноглобулинов класса G при исследовании первой и повторных проб.
6. Обработанные для исследования в РТГА сыворотки в разведении 1:10 сохраняют титр специфических антител почти без изменений в течение нескольких недель, если их хранить в хорошо закрытых резиновыми пробками флаконах или запаянных ампулах.
7. В целях экономии ингредиентов рекомендуется проводить обследование сывороток в РТГА в два этапа: а) исследовать все сыворотки в разведении 1:10, 1:20 и 1:40; б) сыворотки, подавляющие гемагглютинацию в титре 1:40, исследовать повторно в разведениях до 1:1280-1:2560.

Реакция связывания комплемента (РСК)

РСК выполняют в соответствии с наставлением по постановке этой реакции, прилагаемым к диагностикуму, который выпускает предприятие - изготовитель. В качестве дополнения к этому наставлению нужно принимать во внимание следующее.
1. Необходимо помнить, что рН физиологического раствора для РСК должен равняться 7,2. В среде с неоптимальным рН чувствительность реакции снижается. Чувствительность и специфичность во многом зависят от точности измерений при выполнении опытов и тщательности стандартизации реагентов по отношению один к другому, особенно при постановке реакции в малых объемах. Неточности, допущенные в отношении любого из пяти компонентов РСК, ведут к значительной суммарной ошибке конечного результата и невозможности его воспроизведения при повторной реакции.
2. Перед началом исследования любой серии диагностикума нужно определить, соответствует ли его титр указанному на этикетке ампулы. С этой целью проводят шахматное титрование: кроме рабочего, в опыт включают разведения антигена в 2 и в 4 раза меньше и больше, титруют с возрастающими разведениями специфической сыворотки (1:8, 1:16 и т. д. до разведения, в 2 раза превышающего титр, указанный на этикетке). Контролями к этому тесту являются: а) реакция специфической сыворотки во всех разведениях с нормальным антигеном в разведениях, соответствующих рабочему титру диагностикума и более низких, в 2 и в 4 раза; б) реакция нормальной сыворотки в разведении 1:8, 1:16 со специфическим диагностикумом в разведениях, соответствующих рабочему и более низких, в 2 и в 4 раза; в) контроль специфической сыворотки 1:8, 1:16; г) контроль нормальной сыворотки 1:8, 1:16.
При использовании коммерческих антигенов опыт шахматного титрования выполняют одновременно в двух - трех вариантах со всеми дозами комплемента, рекомендуемыми наставлением.
Единицей антигена, или его титром, считают наибольшее его разведение, дающее полное или почти полное связывание комплемента с наибольшим разведением сыворотки. Специфический диагностикум годен для использования, если его титр не ниже, чем указанный в наставлении (как условие годности антигена при проведении переконтроля).
3. Антикомплементарные свойства некоторых сывороток создают затруднение при их исследовании. Природа антикомплементарных свойств различна. У одних людей сыворотки антикомплементарны всегда, у других это свойство появляется периодами. Сыворотки, лишенные этих свойств, могут приобрести их в результате бактериальной контаминации или химического загрязнения, в том числе продуктами гемолиза эритроцитов.
Для освобождения от антикомплементарных свойств предложены следующие методы: а) инактивация 20 минут при +65 град.С (вместо +60 град. С); б) инактивация 20 минут при -60 град. С, проводимая два дня подряд; в) добавление комплемента - на 4 объема неразведенной сыворотки добавляют 1 объем неразведенного комплемента, смесь выдерживают в течение ночи при +4 град. С, затем прогревают 30 минут на водяной бане при +37 град. С, добавляют физиологический раствор до разведения сыворотки 1:4 или 1:8 (до начального разведения для РСК) и прогревают 30 минут при +60 град. С. Все эти методы могут несколько снижать специфический титр, поэтому необходимо аналогичным образом обрабатывать все пробы данного больного, независимо от наличия или отсутствия антикомплементарных свойств его сывороток; г) сыворотки, полученные из сильно гемолизированных проб, становятся пригодными для исследования только после адсорбции гамма - глобулина на ионнообменниках Сефадекс СМ-75 или СМ-100.

Иммуноферментный метод (ИФМ)

Метод основан на принципе сорбции белков на твердой фазе с последующим образованием комплексов антиген - антитело, выявляемых субстрат - индикаторным раствором. Добавляемый затем в лунки антиген специфически связывается с антителами. На слой антигена наносят исследуемые сыворотки людей в нужных разведениях. При наличии в них специфических антител последние связываются с антигеном. Для выявления связывания на слой антител наносят иммуноглобулин против глобулинов сыворотки людей, конъюгированный с пероксидазой хрена. Количество сорбирующегося конъюгата пропорционально количеству связавшихся с антигеном антител сыворотки людей. Это можно определить по степени окрашивания, используя субстратиндикаторный раствор (ортофенилендиамин+перекись водорода), компоненты которого в результате действия пероксидазы конъюгата окрашивают раствор в коричневато - желтый цвет.
Испытание ИФМ, проведенное в нескольких вирусологических лабораториях санэпидстанций в процессе обследования больных КЭ людей, вакцинированных и населения, показали, что этот метод может полностью заменить РТГА, РСК. С помощью ИФМ выявляют антитела к вирусу КЭ раньше и в более высоких разведениях сывороток, чем в РТГА, а также чаще определяют изменение напряженности специфического иммунитета, необходимое для подтверждения клинического диагноза.
Институтом полиомиелита и вирусных энцефалитов АМН СССР разработана "тест - система иммуноферментная для определения антител к вирусу клещевого энцефалита", представляющая собой комплект биологических и химических препаратов. Испытание нескольких серий этой тест - системы в ГИСК им. Л.А.Тарасевича Минздрава СССР подтвердили высокую чувствительность и специфичность ИФМ. Подготовлена инструкция по изготовлению и контролю тест - системы и инструкция по ее применению. Планируется выпуск коммерческого комплекта препаратов (тест - системы).

Оценка результатов серологической диагностики

Серологический диагноз основывается на появлении или нарастании (четырехкратном и выше) титра специфических антител, определяемым любым из методов. В таких случаях клинический диагноз считают достоверно подтвержденным. Стабильный титр антител во всех пробах крови больного, взятых в разные сроки от начала болезни, не является достоверным свидетельством для подтверждения или исключения клинического диагноза, так как в крови жителей эндемичных областей могут быть выявлены специфические антитела, сформировавшиеся в процессе естественной иммунизации, а также у вакцинированных. Отрицательные результаты исследования проб крови на протяжении не менее 2 месяцев от начала заболевания или 1-1,5 месяцев после исчезновения симптомов заболевания свидетельствуют против клещевого энцефалита.
При оценке результатов серологического исследования необходимо принимать во внимание следующее: срок обследования больного от начала заболевания, особенности клинического течения болезни, возможность наличия у больного специфического иммунитета, сформировавшегося в процессе естественной или искусственной (вакцинация, введение специфического гаммаглобулина) иммунизации, оказавшегося по тем или иным причинам недостаточно напряженным, введение с лечебной целью лекарственных препаратов, влияющих на функцию иммунной системы. При позднем начале обследования титр антител в 1 пробе крови может оказаться наивысшим. Вследствие этого показатели исследования парных сывороток будут одинаковыми. Такие же показатели можно получить при обследовании крови больных, вакцинированные до заболевания или иммунизированных естественным путем, - титр антител у них очень быстро достигает максимальной величины. Выявление специфических антител в 1 пробе крови может быть обусловлено пассивным иммунитетом, если незадолго до взятия крови на исследование больному вводили специфический гаммаглобулин высокого титра. Замедленное формирование гуморального иммунитета отмечают при тяжелых формах заболевания, двухволновом течении КЭ, при угнетении функций иммунной системы некоторыми лечебными препаратами, при введении гаммаглобулина с профилактической или лечебной целью, а также в случаях ослабления общего состояния организма предшествующими или хроническими заболеваниями.
Наиболее чувствительным методом выявления специфических антител является ИФМ, однако в практике серологическое обследование начинают с РТГА. Этот метод достаточно чувствителен и прост. Получение показателей, свидетельствующих о нарастании напряженности иммунитета, позволяет закончить исследование на этом этапе и выслать в лечебное учреждение результат с достоверным подтверждением клинического диагноза. Если показатели титра антител в РТГА без диагностического нарастания, парные сыворотки дополнительно исследуют в РСК, рассчитывая на более позднее формирование комплементсвязывающих антител. При стабильном титре антител по данным РСК существенную помощь может оказать исследование крови больного в РСК через 3 месяца после болезни и позже: падение титра специфических антител, четырехкратное или более, указывает на недавнюю инфекцию. Отсутствие специфических антител в I и II пробах крови указывает на необходимость исследовать III пробу, взятую через 2 месяца от начала болезни или 1-1,5 месяца после исчезновения симптомов заболевания. При отсутствии антител в этот период диагноз считают неподтвержденным. Следует иметь в виду, что в сочетанных эндемичных очагах КЭ и омской геморрагической лихорадки трудно установить специфичность иммунитета в связи с тем, что в РСК и в еще большей степени в РТГА выявляется антигенное родство возбудителей этих заболеваний.
Использование ИФМ в качестве основного метода исследования крови больных или для обследования неясных, по данным РТГА и РСК, случаев позволяет увеличить достоверность лабораторной диагностики КЭ вследствие большей чувствительности этого метода. Для дополнительного серологического обследования материалов от больных при наличии необходимых ингредиентов и навыков можно использовать ряд других методов: реакцию нейтрализации, диффузной преципитации в агаре (РДПА), непрямой гемагглютинации (РНГА), радиального гемолиза в геле (РРГ), метод выявления в РТГА специфических антител класса М с помощью обработки сывороток 2-меркаптоэтанолом или удаления иммуноглобулинов класса G стафилококковым реагентом. При этом следует пользоваться соответствующими методическими указаниями и рекомендациями, утвержденными Минздравом СССР.
Существенную помощь в постановке диагноза КЭ может оказать исследование специфического клеточного иммунитета. С этой целью используют метод торможения миграции лимфоцитов.
Следует помнить, что при серологической диагностике КЭ необходимым условием является исследование парных сывороток в одном опыте. Запрещается анализировать результаты исследования отдельных проб из разных опытов. В связи с этим все пробы крови больного сохраняют несколько месяцев до конца периода обследования.
При исследовании сывороток больных необходимо соблюдать правила, установленные для работы с вирусом клещевого энцефалита, так как в пробах крови может присутствовать возбудитель КЭ или другой инфекции в случаях неточности клинической диагностики.
Перечисленные серологические методы применяются также для изучения иммунной прослойки населения и животных в природных очагах и для исследования иммунитета у лиц, вакцинированных против КЭ.

Вирусологическая диагностика

Приготовление материала для заражения

В качестве материала для заражения (инокулята) используют суспензии, приготовленные из сгустка крови или гепаринизированной крови, сыворотку, плазму и спинномозговую жидкость больных. Во избежание аутоинтерферирующего действия вируса и токсического эффекта инокулята сыворотку, плазму и спинномозговую жидкость разводят физиологическим раствором 1:10, 1:50. Из мозга людей, умерших от клещевого энцефалита, готовят после измельчения в стерильных фарфоровых ступках 10% суспензии на физиологическом растворе, на растворе Хенкса или среде для культуры клеток рН 7,0-7,2, если суспензию используют для заражения культур клеток. К физиологическому раствору и растворам, на которых готовят суспензии, в качестве стабилизатора вируса добавляют бычий альбумин (0,75%) или инактивированные прогреванием и проверенные на отсутствие специфических антител сыворотки крупного рогатого скота, эмбрионов коров, лошади или кролика до 30%. Полученные суспензии перед инокуляцией осветляют центрифугированием при 1500-2000 об/мин 10-15 минут. Для заражения используют недосадочную жидкость. Оставшиеся суспензии хранят при температуре не выше -20 град. С для реизоляции агентов.
Исследование клещей, собранных в природных очагах, а также крови и органов животных с целью выделения вируса проводят с помощью тех же методов.
Материалы, приготовленные для вирусологического обследования в культурах клеток и на животных, должны быть бактериологически стерильными. Для соблюдения этого условия: а) загрязненные материалы обрабатывают антибиотиками (пенициллин - 1000 единиц и стрептомицин - 500 единиц на 1 мл); б) в растворы, используемые для приготовления суспензий, добавляют антибиотики в такой же концентрации; клещей перед растиранием в ступке отмывают спиртом или эфиром, а затем стерильным физиологическим раствором с антибиотиками.
Выбор метода выделения вируса. Для выделения возбудителя КЭ наиболее пригодными являются перевиваемая культура клеток СПЭВ и белые мыши в возрасте 1-3 суток, так как они обладают высокой чувствительностью к вирусу. Несколько менее чувствительна к вирусу КЭ культура клеток куриного эмбриона, но при отсутствии клеток СПЭВ и новорожденных белых мышей ее также можно использовать для указанной цели.
Наиболее надежно выделять вирус параллельным заражением исследуемым материалом клеток СПЭВ (2 пассажа) и белых мышей. На практике чаще всего приходится ограничиваться либо заражением культуры клеток, либо заражением белых мышей в возрасте 1-3 суток.
В случае выделения вируса в культуре клеток идентификацию (а при использовании культур клеток куриного эмбриона и индикацию) выделенного агента проводят методом флуоресцирующих антител на втором пассаже исследуемого материала.
При необходимости длительного хранения вируса культуральной жидкостью заражают молодых белых мышей весом 6-7 г и хранят мозг заболевших мышей при температуре не выше -20 град. С.
Заражение белых мышей. Обследуемый инокулят непосредственно после приготовления вводят новорожденным белым мышам в мозг в объеме 0,01-0,02 мл. Каждой пробой заражают по 6-8 животных. Срок наблюдения составляет 14 дней. Мозг мышей, заболевших и погибших через 3 дня и более после заражения, используют для последующих пассажей.
Заражение культур клеток. Каждой пробой заражают по 2-4 пробирки с монослоем по 0,1 мл инокулята на пробирку. Адсорбцию вируса на клетках проводят в течение 1 часа при комнатной температуре или 30 минут при +37 град. С, после чего в пробирки вносят поддерживающую среду (среда 199 на растворе Эрла, рН 7,6) с 3% прогретой при +56 град. С (инактивированной) бычьей сыворотки. В зависимости от количества вируса в инокуляте накопление его достигает максимума через 3-6 суток инкубации культуры клеток. На третьи сутки делают второй пассаж исследуемого материала ин витро, за которым наблюдают в течение 7 дней.
Размножение вируса КЭ в клетках СПЭВ приводит к разрушению клеток, обусловленному цитопатической активностью вируса. Наблюдение за инфицированными культурами обычно проводят до наступления неспецифической дегенерации клеток в контрольных пробирках. Во всех клетках другого вида вирус КЭ размножается без признаков регулярного цитопатического действия. Иногда в сомнительных случаях для выявления вируса требуется провести дополнительные пассажи.
Индикация и идентификация выделенного вируса КЭ. В культуре клеток СПЭВ вирус КЭ обнаруживают по характерному цитопатогенному действию, идентифицируют прямым или непрямым методом флуоресцирующих антител. В культуре клеток куриного эмбриона методом флуоресцирующих антител осуществляют как идентификацию, так и индикацию вируса.
В наибольшей концентрации вирус КЭ накапливается в головном мозге новорожденных белых мышей, а также молодых мышей массой 6-8 г. Поэтому в случае выделения вируса на мышах из мозга заболевших животных (II-III пассаж вируса) готовят антиген на боратно - солевом растворе, рН 0,9, для идентификации вируса в РСК. Мозг заболевших мышей можно использовать в качестве антигена для реакции торможения гемагглютинации и в реакции нейтрализации.
Прямой и непрямой методы флуоресцирующих антител позволяют осуществлять экспресс - индикацию вируса КЭ в инфицированных культурах клеток. В первом случае клетки, зафиксированные в ацетоне, обрабатывают гаммаглобулиновой фракцией иммунной сыворотки к вирусу КЭ, меченной изотиоцианатом флуоресцеина (ФИТЦ), во втором - специфической иммунной сывороткой, содержащей антитела к вирусу КЭ, и затем соответствующей антивидовой сывороткой, меченной ФИТЦ.
Меченые коммерческие антивидовые сыворотки доступны для приобретения. Ниже дано описание этой модификации метода. Вирус - содержащим материалом в разведении 1:10 - 1:50 заражают культуры клеток СПЭВ или куриных эмбрионов, выращенные на покровных стеклах, в пробирках или пенициллиновых флаконах. Выявление вирусного антигена проводят на 2 сутки 2-го пассажа после заражения. Для этого пинцетом вынимают 4-6 покровных стекол из пробирок с зараженной и контрольной культурой, споласкивают их физиологическим раствором, высушивают и фиксируют охлажденным ацетоном 15 минут. Затем на клетки наносят по капле разведенной 1:10 иммунной асцитической жидкости или сыворотки, содержащей антитела к вирусу КЭ, и препараты инкубируют во влажной камере при +37 град. С в течение 1 часа. После тщательной отмывки препаратов от несвязавшейся сыворотки физиологическим раствором их высушивают, на клетки наносят смесь 1:1 соответствующего антивидового гаммаглобулина (против глобулинов мыши, другого лабораторного животного или человека), меченного ФИТЦ, и бычьего альбумина, меченного родамином сульфафторидом, в рабочих разведениях, указанных на этикетках. Родамин сульфафторид используют для окраски нормальных клеток с целью контрастирования специфического свечения ФИТЦ, связанного с антигеном вируса. Препараты вновь инкубируют во влажной камере (+37 град., 30 минут), отмывают физиологическим раствором и просматривают под люминесцентным микроскопом. В цитоплазме клеток, содержащих антиген вируса КЭ обнаруживается характерное зеленое свечение. Нормальные клетки имеют неяркую оранжевую или коричневую окраску.
Выделение вируса от больного является одним из важных дифференциальных признаков при диагностике случаев КЭ. При обследовании материала от умерших в раннем периоде болезни, когда нет возможности выявить динамику специфических антител, выделение возбудителя остается единственным методом диагностики. Отрицательный результат вирусологического обследования не исключает диагноза, так как успех во многом зависит от того, в какой стадии заболевания получен материал для выделения вируса, а также от правильной обработки материала после сбора и соблюдения условий пересылки его в лабораторию. Длительность периода вирусемии не превышает 7 дней от начала заболевания. При обследовании в первые 4 дня частота выделения вируса из крови и спинномозговой жидкости может равняться 12-40%.
Необходимое для исследования время:
а) при вирусологическом исследовании в культуре ткани с индикацией вируса методом МФА - 7 дней, методом заражения новорожденных мышей - 14 дней;
б) при серологическом исследовании при наличии всех необходимых ингредиентов результаты исследования получают через 24 часа.
Определение вирусофорности клещей и частота выделения вируса от животных являются важными элементами эпидемиологической характеристики природных очагов и используются для прогнозирования заболеваемости КЭ, а также при определении эффективности истребительных мероприятий.
Для проведения вирусологического исследования клещей следует также руководствоваться методическими рекомендациями "Вирусологическое исследование отдельных экземпляров иксодовых клещей с использованием методов микроанализа", утвержденными Главным санитарно - эпидемиологическим управлением Министерства здравоохранения СССР 11.08.86г. N 4135-86.

Начальник Управления
специализированной медицинской помощи
Министерства здравоохранения СССР
А.Н.ДЕМЕНКОВ

Начальник Главного
эпидемиологического управления
Министерства здравоохранения СССР
М.И.НАРКЕВИЧ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

КЭ - клещевой энцефалит
РНГА - реакция непрямой гемагглютинации
РГА - реакция гемагглютинации
РПГА - реакция подавления гемагглютинации
РСК - реакция связывания комплемента
РДПА - реакция диффузной преципитации в агаре
МФА - метод флуоресцирующих антител
РН - реакция нейтрализации
РРГ - реакция радиального гемолиза
ЦПД - цитопатогенное действие
СПЭВ - культура клеток почек эмбриона свиньи
ПЭС - культура клеток почек эмбриона свиньи
ФИТЦ - флуоресцеин изотиоцианата
ПЭГ - полиэтиленгликоль
ИАЖ - иммунная асцитическая жидкость

Приложение N 3
к приказу Минздрава СССР
от 9 апреля 1990 г. N 141

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
ПО ЭПИДЕМИОЛОГИИ И ПРОФИЛАКТИКЕ КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА

Методические указания разработаны Институтом полиомиелита и вирусных энцефалитов АМН СССР, Институтом медицинской паразитологии и тропической медицины им. Е.И.Марциновского Минздрава СССР, Главным эпидемиологическим управлением Министерства здравоохранения СССР.
Методические указания разрешается размножить в необходимом количестве экземпляров.

Эпидемиология

Природные очаги клещевого энцефалита широко распространены в лесной и лесостепной зонах на территории СССР (а также в Европе и Азии).
В разных частях ареала клещевого энцефалита его природные очаги отличаются по степени эпизоотической активности, что связано с особенностями зональных, региональных и местных природных условий. Уровень заболеваемости населения клещевым энцефалитом определяется, с одной стороны, эпизоотической активностью очагов, которая существенно меняется в разные годы под влиянием сложных биоценотических процессов, а с другой стороны - характером хозяйственно - бытовой деятельности населения, от которой зависят интенсивность и формы его контакта с природными очагами.
В природных очагах вирус клещевого энцефалита циркулирует по цепи: клещи - дикие позвоночные - клещи. Основное эпизоотологическое и эпидемиологическое (как источник заражения человека вирусом) значение имеют иксодовые клещи двух видов: таежный клещ Ixodes persulcatus P. sch, распространенный в лесной зоне СССР от Прибалтики до Тихого океана и европейский лесной клещ Ixodes ricinus L.), восточная часть области распространения которого находится в Советском Союзе. Она занимает территорию лесной зоны от западных границ СССР примерно до среднего течения реки Волги. Таким образом, в пределах значительной части ареала клещевого энцефалита, расположенной на Европейской территории СССР, могут встречаться оба указанных вида переносчиков.
Развитие иксодовых клещей включает следующие последовательные фазы метаморфоза: яйцо, личинка, нимфа, имаго. Переход из одной фазы развития в другую (кроме перехода из фазы яйца), а также откладка яиц (т.е. начало новой генерации) происходит только после питания кровью позвоночных животных, главным образом млекопитающих и птиц. По ходу метаморфоза клещей осуществляется трансовариальная и трансфазовая передача вируса.
Люди заражаются клещевым энцефалитом чаще всего трансмиссивным путем, в результате присасывания голодных инфицированных взрослых клещей (реже нимф), которые вводят вирус со слюной при кровососании. Заражения обычно происходят вследствие укуса самок клещей, которые имеют длительный период кровососания и могут вводить значительные дозы вируса. Самцы присасываются на небольшой срок; хотя известны четко документированные случаи заболеваний после укуса, самцы клещей имеют меньшее эпидемиологическое значение. Клещи обычно нападают на людей во время посещения леса, но заражение может произойти и от клещей, занесенных из леса в жилые помещения на одежде, с цветами, а также домашними животными. Другой путь заражения - алиментарный, при употреблении в пищу сырого молока коз (реже коров), которое в данный момент содержит вирус, а также приготовленных из него продуктов. Отмечены случаи заболевания клещевым энцефалитом лиц, работавших с вирулентными штаммами вируса в лаборатории, при непосредственном внедрении вируса через мелкие повреждения кожи и слизистых в результате нарушения требований режима работы с возбудителем.
Больной человек не имеет эпидемиологического значения в распространении клещевого энцефалита и является тупиком инфекции.
В природе голодные активные клещи поднимаются по растениям (чаще всего на высоту до 1 м от земли) и принимают подстерегающую позу. Они нападают на проходящего человека, прицепляясь к одежде. Это может происходить как днем, так и ночью, причем не только при ясной, но и при дождливой погоде. Напавшие клещи обычно ползут наверх и стремятся проникнуть под одежду. Они могут прикрепляться к любой части тела, но чаще всего клещи присасываются к шее, в складках кожи в области пояса, в волосистых частях тела, в паху. С момента наползания клещей до их прикрепления обычно проходит некоторое время (примерно 1-2 часа). Важно иметь ввиду, что клещи присасываются не только непосредственно в лесу. Если они остались на одежде или вещах, это может произойти по дороге из леса, в транспорте или уже дома, когда внимание и настороженность людей ослабевают. Нередки случаи присасывания клещей к спящим людям; при этом прикрепившихся клещей обычно долго не обнаруживают.
Момент прикрепления (укуса) клеща ощущается далеко не всегда. Это связано как с различной индивидуальной чувствительностью людей, так и с локализацией укуса. В целом укус клеща малочувствителен и часто остается незамеченным. На второй - третий день на поверхности тела вокруг присосавшегося клеща в большинстве случаев появляется гиперемия и возникает болезненное ощущение (местная реакция на укус). Прикрепившихся клещей, как правило, обнаруживают не позднее этого периода. До этого момента клещи отделяются от хозяина с трудом: полностью напитавшиеся особи отпадают самостоятельно.
При снятии, раздавливании клеща или расчесывании места укуса также может произойти заражение клещевым энцефалитом в результате втирания в кожу со слюной или тканями клеща возбудителя инфекции.
Для заболеваний клещевым энцефалитом характерна весенне - летняя сезонность, обусловленная периодом активности клещей, которая связана с региональными природно - географическими условиями и погодными условиями и видом переносчика. В очагах с основным переносчиком Ixodes persulcatus большинство заражений происходит весной и в первую половину лета, во время наибольшей сезонной численности взрослых клещей. Клещ Ixodes ricinus обычно имеет два сезонных пика активности: весной и в конце лета - начале осени. Соответственно, на значительной территории Европейской части нашей страны эти периоды наиболее опасны.
К заражению клещевым энцефалитом восприимчивы все люди, независимо от возраста и пола. Наибольшему риску заражения подвержены лица, работа которых связана с пребыванием в лесу: работники леспромхозов и лесхозов, геологоразведочных партий, лесных баз отдыха, строители автомобильных и железных дорог, нефте- и газопроводов, линий электропередач, топографы, охотники и т.п., а также лица, прибывающие в эндемичные районы из благополучных по клещевому энцефалиту местностей. Заражения сельских жителей чаще всего происходят на хорошо обжитой территории, в радиусе 3-8 км от населенного пункта при посещении леса по хозяйственно - бытовым нуждам и во время отдыха (заготовка дров, сбор грибов, ягод, сенокос, охота, рыбалка, прогулка и т.д.). Горожане заражаются в пригородных лесах, лесопарках, на индивидуальных садово - огородных участках, а также на расстоянии десятков и сотен километров от городов.

Эпидемиологическое обследование случая заболевания
или подозрения на заболевание клещевым энцефалитом

Санитарно - эпидемиологическая станция по получении "Экстренного извещения об инфекционном заболевании, пищевом, остром профессиональном отравлении, необычной реакции на прививки" (уч. ф. N 058/у) на случай заболевания или подозрения на заболевание клещевым энцефалитом, проводит эпидемиологическое обследование данного случая.
Результаты эпидемиологического обследования заносятся в "Карту эпидемиологического обследования очага инфекционного заболевания" (уч. ф. N 357/у). Краткие сведения об очаге инфекции при опросе больного и при обследовании очага на месте: шифр, номер участка, квартала (леса, лесопарка, парка) и т.п. заносятся в карту согласно принятой в данной санэпидстанции номенклатуре (см. "Методические указания по организации и проведению противоклещевых мероприятий и биологических наблюдений в природных очагах клещевого энцефалита", утв. Главным управлением карантинных инфекций Минздрава СССР 02.10.87 г. N 28-6/33).
При заполнении эпидкарты следует иметь в виду:
В разделе 1 "Сведения о больном" заполняются все пункты. Кроме того:
- п.14 "Основные симптомы в первые дни болезни" дополнить сведениями о том, отмечал ли больной присасывание клеща и обращался ли в связи с этим в медицинское учреждение;
- п.26. "Диагноз подтвержден" - в таблице приводятся результаты серологического исследования (в соответствующей строке) и вирусологического исследования на клещевой энцефалит материала от больного (в строке "микроскопически");
пп.27, 28 заполняются на основании медицинской документации (после уточнения данных опросов больного).
В разделе II "Поиск источника и фактора передачи инфекции" заполняются пп. 28, 29, 31.
Пункт 29 заполняется со слов больного с кратким описанием вероятного места заражения по принятой в данной санэпидстанции номенклатуре.
В виде отдельной (самостоятельной) строки выделяется:
"работа в лесу в связи с профессиональной деятельностью".
Пребывание в лесу с хозяйственно - бытовыми целями (заготовка дров, ягод, грибов, сенокос и т.п.) заносятся в строку "Отдых в природных условиях...".
В строку "Прочие" заносятся случаи заражения клещевым энцефалитом вероятнее всего связанные с заносом клещей из леса с цветами, ветками и т.п.
Данные об алиментарном заражении клещевым энцефалитом заносятся в таблицу п.31 "Сведения о пищевых продуктах...".

1 2 3 4 5

	Приказ 9 апреля 1990 г. N 141 о дальнейшем совершенствовании мероприятий... Методические указания по клинике, диагностике и лечению клещевого энцефалита (Приложение 1)		Перед поездкой в район с повышенным риском заражения клещевым энцефалитом,... Купите заранее препарат Йодантипирин (используется для экстренной профилактики клещевого энцефалита у взрослых и детей с 14 лет)....
	Приказ от 28 декабря 2000 г. N 457 о совершенствовании пренатальной... В целях совершенствования пренатальной диагностики в профилактике наследственных и врожденных заболеваний у детей, предупреждения...		Приказ от 28 декабря 2000 г. N 457 о совершенствовании пренатальной... В целях совершенствования пренатальной диагностики в профилактике наследственных и врожденных заболеваний у детей, предупреждения...
	Приказ 26 ноября 1997 г. N 345 о совершенствовании мероприятий по... ...		Приказ 26 ноября 1997 г. N 345 о совершенствовании мероприятий по... ...
	О совершенствовании мероприятий по профилактике вертикального пути Вич-инфекции с применением наиболее эффективных и безопасных методов профилактики, что требует усиления взаимодействия между акушерско-гинекологической,...		Приказ г. Челябинск «27» 12. 2010 г. №1692/456 Об усилении мероприятий... По результатам проведенного ретроспективного анализа фгун «Омский научно-исследовательский институт природно-очаговых инфекций»,...
	Ветеринарной защиты здоровья животных Системно изложен комплекс мероприятий по диагностике, терапии и профилактике стресса, неинфекционных заболеваний, факторных инфекций,...		Приказ минздрава РФ от 26. 11. 97 №345 о совершенствовании мероприятий... Федеральной целевой программы "Безопасное материнство", утвержденной Постановлением Правительства Российской Федерации от 14. 10....
	Приказ Об организации мероприятий по профилактике гриппа и острых респираторных вирусных инфекций в Вологодской области в эпидемический...		Оперативный план мероприятий по профилактике острых кишечных инфекций... Основная задача: эффективная работа по профилактике оки всех служб (здравоохранения и образования) в период сезонного подъёма и широкая...
	Протокол №5 видеоконференции Департамента здравоохранения Курганской... Эпидемиологическая ситуация по заболеваемости клещевым вирусным энцефалитом на территории Курганской области		Приказ от 21 марта 2003 г. N 109 о совершенствовании противотуберкулезных... Численность впервые выявленных больных туберкулезом по сравнению с 1990 г увеличилась к 2003 г более чем в 2 раза, в 1,5 раза возросла...
	Приказ Минздравмедпрома РФ от 29 апреля 1994 г. N 82 "О порядке проведения... Во исполнение статьи 48 Основ законодательства Российской Федерации об охране здоровья граждан, в целях упорядочения организации...		Приказ от 21 марта 2003 года n 109 о совершенствовании противотуберкулезных... О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации (с изменениями на 29 октября 2009 года)

Похожие: