Методические рекомендации Большие Вяземы 2013

Скачать 0.49 Mb.

Название	Методические рекомендации Большие Вяземы 2013
страница	1/4
Тип	Методические рекомендации

rykovodstvo.ru > Руководство эксплуатация > Методические рекомендации

1 2 3 4

Федеральное агентство научных организаций

Российская академия сельскохозяйственных наук

Отделение защиты и биотехнологии растений

Всероссийский научно-исследовательский институт фитопатологии
«Усовершенствованные способы хранения штаммов Государственной коллекции фитопатогенных микроорганизмов и сортов-идентификаторов (дифференциаторов) патогенных штаммов микроорганизмов»

Методические рекомендации

$c:\users\коллекция\desktop\к отчету за 2013 год\sam_0314.jpg$

Большие Вяземы - 2013

Федеральное агентство научных организаций

Федеральное агентство научных организаций

Российская академия сельскохозяйственных наук

Отделение защиты и биотехнологии растений

Всероссийский научно-исследовательский институт фитопатологии

«Усовершенствованные способы хранения штаммов Государственной коллекции фитопатогенных микроорганизмов и сортов-идентификаторов (дифференциаторов) патогенных штаммов микроорганизмов»

Методические рекомендации

Выходная продукция

по заданию 05.01. Плана фундаментальных и приоритетных прикладных

исследований Россельхозакадемии по научному обеспечению развития АПК

Российской Федерации на 2011-2015 годы

и по Государственному заданию на 2013 год

Большие Вяземы - 2013

Методические рекомендации составлены зав. Государственной коллекцией фитопатогенных микроорганизмов ВНИИФ, канд. биол. наук Жемчужиной Н.С., врио зав. лаб. бактериальных болезней растений, доктором биол. наук Игнатовым А.Н., зав. лаб. болезней картофеля и овощных культур, канд. биол. наук Кузнецовой М.А., ст. научн. сотр. лаб. болезней картофеля и овощных культур, канд. биол. наук Козловской И.Н., научн. сотр. лаб. болезней картофеля и овощных культур Морозовой Е.В., зам. зав. отд. микологии и иммунитета, вед. научн. сотр. Коломиец Т.М., зав. лаб. диагностики фитопатогенных организмов, канд. биол. наук Приданниковым М.В., ст. научн. сотр. отд. микологии и иммунитета, канд. биол. наук Пахолковой Е.В.

Всего в работе принимали участие 34 человека шести структурных подразделений института, в том числе 1 доктор наук, 15 кандидатов наук, 7 науч. сотр., 1 мл. науч. сотр. и 10 лаборантов.

Введение

Несмотря на постоянное углубление знаний в области генетики, биохимии, физиологии и экологии микроорганизмов, еще далеко до понимания полной картины о процессах, ответственных за обратимый переход клеток микроорганизмов в анабиотическое состояние. За многолетнюю историю активного изучения мира микроорганизмов и создания их коллекций накопились общие, но не вполне четкие представления по управлению процессами консервации и восстановления жизнеспособности каждого конкретного организма. При сопоставлении количества создаваемых рекомбинантных микроорганизмов с немногочисленными приемами их хранения, основанными на общебиологических представлениях о строении и физиологии микробных клеток, становится понятным явное отставание знаний в области конкретных подходов. Интерес к работам по исследованию структурно-функциональных перестроек клеток микроорганизмов под воздействием факторов консервации-реактивации начал стремительно расти в 60–70 гг., вероятно, после нахождения живых микробов во льдах Арктики (1, 2), но существенно уменьшился в конце 80-х гг. прошлого столетия. Багажа знаний в этой области могло оказаться достаточно, чтобы вполне удовлетворительно применять его десятилетиями в практической работе.

Богатый опыт работы с коллекциями [3–5] свидетельствует о том, что ряд современных методов консервации оказывается относительно эффективным при поддержании лабораторных культур микроорганизмов. Однако эффективная консервация с полным сохранением популяций и геномов представляет собой проблему, особенно если учесть необычайное физиологическое разнообразие микроорганизмов. Актуальным остается анализ природных процессов, в ходе которых многие микроорганизмы успешно сохраняются в природе, несмотря на весьма жесткие там условия. Практика консервации, развивавшаяся на протяжении многих десятилетий, выработала ряд приемов, соответствующих тем механизмам погружения клеток в анабиотическое состояние, которые были выявлены при изучении образования и свойств специализированных покоящихся клеток микроорганизмов.

Однако, используются не все возможности и не все их комбинации. Существующая практика консервации ориентируется обычно на задачу создания по возможности немногочисленных и специализированных приемов, позволяющих перевести в анабиотическое состояние вегетативные клетки разнообразных микроорганизмов.

Работы по выяснению более четких представлений по управлению процессами консервации и восстановления жизнеспособности конкретных микроорганизмов сохраняют актуальность. Поддержание штаммов в рабочем состоянии, сохранение их ценных свойств являются важными условиями практически любой работы с микроорганизмами – от первичного изучения до использования их в научных исследованиях.
Коллекция фитопатогенных микроорганизмов ВНИИФ создана в результате многолетних исследований видовой и внутривидовой структуры популяций фитопатогенов в разных зонах страны и предназначена для проведения фитопатологических, иммунологических, селекционных, генетических, токсикологических, паразитологических и других исследований. Коллекция начала создаваться около полувека назад и содержит штаммы, изоляты и образцы возбудителей наиболее вредоносных болезней зерновых, картофеля, технических и овощных культур, относящихся к грибам, бактериям, вирусам, вироидам и нематодам и имеет статус государственной. Сейчас в коллекции насчитывается более 5 тыс. штаммов и изолятов фитопатогенов и, естественно, на первом месте стоит вопрос о сохранении жизнеспособности и свойств фитопатогенных грибов, оомицетов, бактерий, вирусов и нематод. В связи с этим сотрудники коллекции постоянно проводят работу по разработке и внедрению современных надежных методов хранения различных видов фитопатогенов. Результаты этих исследований предлагаются в настоящих рекомендациях.

Цель: описание традиционных и усовершенствованных методов хранения фитопатогенных микроорганизмов и определение оптимальных условий хранения для различных видов фитопатогенов.

Хранение коллекционных культур ржавчинных грибов

Коллекционные культуры ржавчинных грибов хранят в виде урединиоспор. Для долгосрочного хранения используют метод криоконсервации. Для краткосрочного хранения образцов ржавчин используют бытовые холодильники с температурой 4-5˚С, где урединиоспоры грибов могут храниться в пробирках, закрытых ватными тампонами, в течение 2-3 месяцев, а в виде гербарного материала – в течение 10-12 месяцев.

Криоконсервация

Для криоконсервации урединиоспор ржавчинных грибов долгое время использовали сосуды Дьюара с жидким азотом (-195⁰С), который позволял сохранять высокую жизнеспособность инфекционного материала в течение продолжительного времени (10 и более лет). Однако этот метод довольно трудоемкий и небезопасный. Кроме того, в связи с тем, что жидкий азот поступал нерегулярно, и за годы хранения коллекции нередко отмечалось его длительное отсутствие, часть образцов утратила жизнеспособность.

С 2003 года штаммы грибов рода Puccinia хранятся в низкотемпературном шкафу Revko при температуре -80˚С. Урединиоспоры изолятов закладывают в желатиновые капсулы, которые по две помещают в криопробирки. Каждая пробирка имеет индивидуальный штрих-код (рис.1).

$c:\users\коллекция\desktop\к отчету за 2013 год\директор_2013\sam_0282.jpg$

Рис. 1. Желатиновые капсулы со споровым материалом бурой ржавчины и криопробирки.

Жизнеспособность и патогенность хранящегося материала регулярно проверяются. Проверку жизнеспособности проводят путем посева снятых с хранения и выведенных из состояния анабиоза урединиоспор на голодный агар. Для выведения из состояния анабиоза урединиоспоры после криоконсервации помещают в воду с температурой +43⁰С или в термостат с температурой +45⁰С на 5 мин.

Сразу после этого часть спор используют для определения жизнеспособности на голодном агаре. Споры наносят на агар с помощью препаровальной иглы легким постукиванием по краю чашки Петри. Затем чашки закрывают и оставляют на 6 часов при комнатной температуре, а в холодное время года – в термостате. Через 6 часов чашки просматривают под микроскопом при большом увеличении и подсчитывают число проросших спор на 100 спор в трехкратной повторности. Затем вычисляют жизнеспособность спор каждого изолята в %. Оставшиеся споры используют для определения жизнеспособности снятых с хранения изолятов на живых растениях. С этой целью готовят водную споровую суспензию каждого штамма. В водопроводную воду с Твином 20 помещают урединиоспоры, тщательно перемешивают суспензию, оставляют на 15 минут и инокулируют растения пшеницы восприимчивого сорта Хакасская. Инокуляцию проводят в фазе 6-7-дневных всходов. С растений удаляют восковой налет и проводят заражение листьев суспензией урединиоспор. Затем опрыскивают водопроводной водой и помещают во влажную камеру при температуре +18º-20ºС на 16-20 часов без дополнительного освещения. После внедрения спор растения переносят в камеру искусственного климата в контролируемые условия температуры, освещенности и влажности (температура +22⁰С днем и +18⁰С ночью, освещенность 10-15 тыс. люксов, влажность 70%, фотопериод 16 часов). Показателем жизнеспособности спор служит образование пустул на поверхности листьев растений.

При хранении спор в бытовом холодильнике более трех месяцев пробирки со спорами предварительно помещают в эксикатор с водой на 2-3 часа, затем инокулируют растения.

Все 34 изолята, снятые с хранения в низкотемпературном морозильнике REVCO в последние годы, показали хорошую жизнеспособность при тестировании на живых растениях (интенсивное развитие болезни) и на голодном агаре (таблица 1).

Таблица 1. Определение жизнеспособности хранящихся при -80⁰С в течение 7 лет изолятов P. triticina

№	Изолят	Происхождение (год, регион, сорт)	% проросших спор на агаре	Жизнеспособность на живых растениях (+/-)
1	490-1	2004, Северо-Кавказский, Ростовская обл., с/н	53.4	+
2	490-9	2004, Северо-Кавказский, Ростовская обл., с/н	55.9	+
3	491-1	2004, Северо-Кавказский, Ростовская обл., с. Крассар	49.6	+
4	491-3	2004, Северо-Кавказский, Ростовская обл., с. Крассар	54.7	+
5	491-5	2004, Северо-Кавказский, Ростовская обл., с. Крассар	53.0	+
6	491-8	2004, Северо-Кавказский, Ростовская обл., с. Крассар	50.8	+
7	491-9	2004, Северо-Кавказский, Ростовская обл., с. Крассар	45.7	+
8	493-1	2004, Северо-Кавказский, Ростовская обл., с. Альбидум 28	51.5	+
9	493-2	2004, Северо-Кавказский, Ростовская обл., с. Альбидум 28	49.5	+
10	493-5	2004, Северо-Кавказский, Ростовская обл., с. Альбидум 28	47.5	+
11	494-1	2004, Северо-Кавказский, Ростовская обл., с. Альбидум 28	45.7	+
12	496-3	2004, Северо-Кавказский, Ростовская обл., с. Альмата	44.0	+
13	496-6	2004, Северо-Кавказский, Ростовская обл., с. Альмата	51.8	+
14	497-8	2004, Северо-Кавказский, Ростовская обл., с. Новодонская	49.6	+
15	498-7	2004, Северо-Кавказский, Ростовская обл., с. Вольнодонская	51.5	+
16	498-8	2004, Северо-Кавказский, Ростовская обл., с. Вольнодонская	54.1	+
17	499-5	2004, Северо-Кавказский, Ростовская обл., с. Аннушка	48.7	+
18	499-6	2004, Северо-Кавказский, Ростовская обл., с. Аннушка	52.3	+
19	500-3	2004, Северо-Кавказский, Ростовская обл., с. Ласточка	43.6	+
20	500-4	2004, Северо-Кавказский, Ростовская обл., с. Ласточка	44.2	+
21	500-5	2004, Северо-Кавказский, Ростовская обл., с. Ласточка	51.7	+
22	500-8	2004, Северо-Кавказский, Ростовская обл., с. Ласточка	51.0	+
23	501-3	2004, Северо-Кавказский, Ростовская обл., Тритикале	41.6	+
24	502-3	2004, Центральный, Московская обл., с. оз. Московская 39	40.8	+
25	502-9	2004, Центральный, Московская обл., с. оз. Московская 39	51.8	+
26	506-4	2004, Центральный, Московская обл., с. оз. Заря	44.7	+
27	514-2	2004, Нижневолжский, Саратовская обл., с. оз. Губерния	33.8	+
28	515-7	2004, Центрально-Черноземный, Белгородская обл., с. оз. Одесская 267	41.6	+
29	517-3	2004, Центрально-Черноземный, Воронежская обл., с. оз. Воронежская 6	39.3	+
30	517-7	2004, Центрально-Черноземный, Воронежская обл., с. оз. Воронежская 6	51.6	+
31	517-8	2004, Центрально-Черноземный, Воронежская обл., с. оз. Воронежская 6	41.9	+
32	540-2	2004, Центральный, Московская обл., с. Эритроспермум 356	52.5	+
33	540-3	2004, Центральный, Московская обл., с. Эритроспермум 356	45.0	+
34	541-6	2004, Центральный, Московская обл., гибридная линия 88/048	40.6	+

Таким образом, проведенные исследования по проверке жизнеспособности изолятов подтверждают тот факт, что переход от хранения в жидком азоте при t=-196˚C на хранение в ультраморозильниках при температуре -80˚С также обеспечивает длительность хранения.

1 2 3 4

Похожие:

	Финансовой и хозяйственной деятельности муп «большие вяземы» за период... Основание: Решение совета депутатов г п. Большие Вяземы одинцовского муниципального района московской области от 23. 12. 2010 г....		Методические рекомендации по организации лабораторной диагностики... Методические рекомендации. Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. 2013 г. – 31с
	Методические рекомендации практического обучения для студентов специальности... З 381 Методические рекомендации практического обучения. Омск: ноу спо «Омский гуманитарный колледж», 2013. – 88 с		Методические рекомендации мр 1 0075/1-13 Издание официальное Роспотребнадзор... «Надзор за распространением штаммов вич резистентных к антиретровирусным препаратам». – Методические рекомендации. – М.: Федеральная...
	Методические рекомендации мр 1 0075/1-13 Издание официальное Роспотребнадзор... «Надзор за распространением штаммов вич резистентных к антиретровирусным препаратам». – Методические рекомендации. – М.: Федеральная...		Методические рекомендации мр 1 0075/1-13 Издание официальное Роспотребнадзор... «Надзор за распространением штаммов вич резистентных к антиретровирусным препаратам». – Методические рекомендации. – М.: Федеральная...
	Постановление Правительства РФ от 17. 12. 2013 года №1177 «Об утверждении... Федеральный закон «Об образовании в Российской Федерации» от 29 декабря 2012 года №273-фз (в ред федеральных законов от 07. 05. 2013...		Конкурс «Большие гонки» Учредитель городского конкурса «Большие гонки» (далее конкурс) мку «Управление культуры Администрации г. Белогорск»
	Методические рекомендации по организации работы сенсорной комнаты... Методические рекомендации предназначены специалистам служб психолого-педагогического сопровождения (педагогам-психологам, учителям-логопедам,...		Методические указания по организации и проведению практики омск, 2013 Методические рекомендации для обучающихся по организации и проведению учебной и производственных практик
	Методические рекомендации мр 1 0076/1-13 Издание официальное Москва,... Методические рекомендации предназначены для специалистов, проводящих обследование населения на маркеры вич-инфекции, специалистов...		Методические рекомендации по выполнению внеаудиторных самостоятельных работ Методические рекомендации предназначены для студентов, обучающихся по специальностям
	Методические рекомендации Санкт-Петербург Принципы этиопатогенетической терапия острых фарингитов: Методические рекомендации / Составитель: С. В. Рязанцев. Спб.:, 32 с		Жилищных и коммунальных услуг и обоснованности Методические рекомендации по расчету размера платы за жилищные услуги (далее Методические рекомендации)
	Методические рекомендации Санкт-Петербург Этиопатогенетическая терапия острых средних отитов: Методические рекомендации / Составитель св. Рязанцев. Спб.: 40 с		Методические рекомендации по изучению дисциплины для студентов 1... Методические рекомендации предназначены для студентов, изучающих курс «Русский язык и культура речи». Методические рекомендации включают...

Руководство, инструкция по применению