Скачать 0.49 Mb.
|
Федеральное агентство научных организаций Российская академия сельскохозяйственных наук Отделение защиты и биотехнологии растений Всероссийский научно-исследовательский институт фитопатологии «Усовершенствованные способы хранения штаммов Государственной коллекции фитопатогенных микроорганизмов и сортов-идентификаторов (дифференциаторов) патогенных штаммов микроорганизмов» Методические рекомендации Большие Вяземы - 2013 Федеральное агентство научных организаций Федеральное агентство научных организаций Российская академия сельскохозяйственных наук Отделение защиты и биотехнологии растений Всероссийский научно-исследовательский институт фитопатологии «Усовершенствованные способы хранения штаммов Государственной коллекции фитопатогенных микроорганизмов и сортов-идентификаторов (дифференциаторов) патогенных штаммов микроорганизмов» Методические рекомендации Выходная продукция по заданию 05.01. Плана фундаментальных и приоритетных прикладных исследований Россельхозакадемии по научному обеспечению развития АПК Российской Федерации на 2011-2015 годы и по Государственному заданию на 2013 год Большие Вяземы - 2013 Методические рекомендации составлены зав. Государственной коллекцией фитопатогенных микроорганизмов ВНИИФ, канд. биол. наук Жемчужиной Н.С., врио зав. лаб. бактериальных болезней растений, доктором биол. наук Игнатовым А.Н., зав. лаб. болезней картофеля и овощных культур, канд. биол. наук Кузнецовой М.А., ст. научн. сотр. лаб. болезней картофеля и овощных культур, канд. биол. наук Козловской И.Н., научн. сотр. лаб. болезней картофеля и овощных культур Морозовой Е.В., зам. зав. отд. микологии и иммунитета, вед. научн. сотр. Коломиец Т.М., зав. лаб. диагностики фитопатогенных организмов, канд. биол. наук Приданниковым М.В., ст. научн. сотр. отд. микологии и иммунитета, канд. биол. наук Пахолковой Е.В. Всего в работе принимали участие 34 человека шести структурных подразделений института, в том числе 1 доктор наук, 15 кандидатов наук, 7 науч. сотр., 1 мл. науч. сотр. и 10 лаборантов. Введение Несмотря на постоянное углубление знаний в области генетики, биохимии, физиологии и экологии микроорганизмов, еще далеко до понимания полной картины о процессах, ответственных за обратимый переход клеток микроорганизмов в анабиотическое состояние. За многолетнюю историю активного изучения мира микроорганизмов и создания их коллекций накопились общие, но не вполне четкие представления по управлению процессами консервации и восстановления жизнеспособности каждого конкретного организма. При сопоставлении количества создаваемых рекомбинантных микроорганизмов с немногочисленными приемами их хранения, основанными на общебиологических представлениях о строении и физиологии микробных клеток, становится понятным явное отставание знаний в области конкретных подходов. Интерес к работам по исследованию структурно-функциональных перестроек клеток микроорганизмов под воздействием факторов консервации-реактивации начал стремительно расти в 60–70 гг., вероятно, после нахождения живых микробов во льдах Арктики (1, 2), но существенно уменьшился в конце 80-х гг. прошлого столетия. Багажа знаний в этой области могло оказаться достаточно, чтобы вполне удовлетворительно применять его десятилетиями в практической работе. Богатый опыт работы с коллекциями [3–5] свидетельствует о том, что ряд современных методов консервации оказывается относительно эффективным при поддержании лабораторных культур микроорганизмов. Однако эффективная консервация с полным сохранением популяций и геномов представляет собой проблему, особенно если учесть необычайное физиологическое разнообразие микроорганизмов. Актуальным остается анализ природных процессов, в ходе которых многие микроорганизмы успешно сохраняются в природе, несмотря на весьма жесткие там условия. Практика консервации, развивавшаяся на протяжении многих десятилетий, выработала ряд приемов, соответствующих тем механизмам погружения клеток в анабиотическое состояние, которые были выявлены при изучении образования и свойств специализированных покоящихся клеток микроорганизмов. Однако, используются не все возможности и не все их комбинации. Существующая практика консервации ориентируется обычно на задачу создания по возможности немногочисленных и специализированных приемов, позволяющих перевести в анабиотическое состояние вегетативные клетки разнообразных микроорганизмов. Работы по выяснению более четких представлений по управлению процессами консервации и восстановления жизнеспособности конкретных микроорганизмов сохраняют актуальность. Поддержание штаммов в рабочем состоянии, сохранение их ценных свойств являются важными условиями практически любой работы с микроорганизмами – от первичного изучения до использования их в научных исследованиях. Коллекция фитопатогенных микроорганизмов ВНИИФ создана в результате многолетних исследований видовой и внутривидовой структуры популяций фитопатогенов в разных зонах страны и предназначена для проведения фитопатологических, иммунологических, селекционных, генетических, токсикологических, паразитологических и других исследований. Коллекция начала создаваться около полувека назад и содержит штаммы, изоляты и образцы возбудителей наиболее вредоносных болезней зерновых, картофеля, технических и овощных культур, относящихся к грибам, бактериям, вирусам, вироидам и нематодам и имеет статус государственной. Сейчас в коллекции насчитывается более 5 тыс. штаммов и изолятов фитопатогенов и, естественно, на первом месте стоит вопрос о сохранении жизнеспособности и свойств фитопатогенных грибов, оомицетов, бактерий, вирусов и нематод. В связи с этим сотрудники коллекции постоянно проводят работу по разработке и внедрению современных надежных методов хранения различных видов фитопатогенов. Результаты этих исследований предлагаются в настоящих рекомендациях. Цель: описание традиционных и усовершенствованных методов хранения фитопатогенных микроорганизмов и определение оптимальных условий хранения для различных видов фитопатогенов. Хранение коллекционных культур ржавчинных грибов Коллекционные культуры ржавчинных грибов хранят в виде урединиоспор. Для долгосрочного хранения используют метод криоконсервации. Для краткосрочного хранения образцов ржавчин используют бытовые холодильники с температурой 4-5˚С, где урединиоспоры грибов могут храниться в пробирках, закрытых ватными тампонами, в течение 2-3 месяцев, а в виде гербарного материала – в течение 10-12 месяцев. Криоконсервация Для криоконсервации урединиоспор ржавчинных грибов долгое время использовали сосуды Дьюара с жидким азотом (-1950С), который позволял сохранять высокую жизнеспособность инфекционного материала в течение продолжительного времени (10 и более лет). Однако этот метод довольно трудоемкий и небезопасный. Кроме того, в связи с тем, что жидкий азот поступал нерегулярно, и за годы хранения коллекции нередко отмечалось его длительное отсутствие, часть образцов утратила жизнеспособность. С 2003 года штаммы грибов рода Puccinia хранятся в низкотемпературном шкафу Revko при температуре -80˚С. Урединиоспоры изолятов закладывают в желатиновые капсулы, которые по две помещают в криопробирки. Каждая пробирка имеет индивидуальный штрих-код (рис.1). Рис. 1. Желатиновые капсулы со споровым материалом бурой ржавчины и криопробирки. Жизнеспособность и патогенность хранящегося материала регулярно проверяются. Проверку жизнеспособности проводят путем посева снятых с хранения и выведенных из состояния анабиоза урединиоспор на голодный агар. Для выведения из состояния анабиоза урединиоспоры после криоконсервации помещают в воду с температурой +430С или в термостат с температурой +450С на 5 мин. Сразу после этого часть спор используют для определения жизнеспособности на голодном агаре. Споры наносят на агар с помощью препаровальной иглы легким постукиванием по краю чашки Петри. Затем чашки закрывают и оставляют на 6 часов при комнатной температуре, а в холодное время года – в термостате. Через 6 часов чашки просматривают под микроскопом при большом увеличении и подсчитывают число проросших спор на 100 спор в трехкратной повторности. Затем вычисляют жизнеспособность спор каждого изолята в %. Оставшиеся споры используют для определения жизнеспособности снятых с хранения изолятов на живых растениях. С этой целью готовят водную споровую суспензию каждого штамма. В водопроводную воду с Твином 20 помещают урединиоспоры, тщательно перемешивают суспензию, оставляют на 15 минут и инокулируют растения пшеницы восприимчивого сорта Хакасская. Инокуляцию проводят в фазе 6-7-дневных всходов. С растений удаляют восковой налет и проводят заражение листьев суспензией урединиоспор. Затем опрыскивают водопроводной водой и помещают во влажную камеру при температуре +18º-20ºС на 16-20 часов без дополнительного освещения. После внедрения спор растения переносят в камеру искусственного климата в контролируемые условия температуры, освещенности и влажности (температура +220С днем и +180С ночью, освещенность 10-15 тыс. люксов, влажность 70%, фотопериод 16 часов). Показателем жизнеспособности спор служит образование пустул на поверхности листьев растений. При хранении спор в бытовом холодильнике более трех месяцев пробирки со спорами предварительно помещают в эксикатор с водой на 2-3 часа, затем инокулируют растения. Все 34 изолята, снятые с хранения в низкотемпературном морозильнике REVCO в последние годы, показали хорошую жизнеспособность при тестировании на живых растениях (интенсивное развитие болезни) и на голодном агаре (таблица 1). Таблица 1. Определение жизнеспособности хранящихся при -800С в течение 7 лет изолятов P. triticina
Таким образом, проведенные исследования по проверке жизнеспособности изолятов подтверждают тот факт, что переход от хранения в жидком азоте при t=-196˚C на хранение в ультраморозильниках при температуре -80˚С также обеспечивает длительность хранения. |
Финансовой и хозяйственной деятельности муп «большие вяземы» за период... Основание: Решение совета депутатов г п. Большие Вяземы одинцовского муниципального района московской области от 23. 12. 2010 г.... |
Методические рекомендации по организации лабораторной диагностики... Методические рекомендации. Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. 2013 г. – 31с |
||
Методические рекомендации практического обучения для студентов специальности... З 381 Методические рекомендации практического обучения. Омск: ноу спо «Омский гуманитарный колледж», 2013. – 88 с |
Методические рекомендации мр 1 0075/1-13 Издание официальное Роспотребнадзор... «Надзор за распространением штаммов вич резистентных к антиретровирусным препаратам». – Методические рекомендации. – М.: Федеральная... |
||
Методические рекомендации мр 1 0075/1-13 Издание официальное Роспотребнадзор... «Надзор за распространением штаммов вич резистентных к антиретровирусным препаратам». – Методические рекомендации. – М.: Федеральная... |
Методические рекомендации мр 1 0075/1-13 Издание официальное Роспотребнадзор... «Надзор за распространением штаммов вич резистентных к антиретровирусным препаратам». – Методические рекомендации. – М.: Федеральная... |
||
Постановление Правительства РФ от 17. 12. 2013 года №1177 «Об утверждении... Федеральный закон «Об образовании в Российской Федерации» от 29 декабря 2012 года №273-фз (в ред федеральных законов от 07. 05. 2013... |
Конкурс «Большие гонки» Учредитель городского конкурса «Большие гонки» (далее конкурс) мку «Управление культуры Администрации г. Белогорск» |
||
Методические рекомендации по организации работы сенсорной комнаты... Методические рекомендации предназначены специалистам служб психолого-педагогического сопровождения (педагогам-психологам, учителям-логопедам,... |
Методические указания по организации и проведению практики омск, 2013 Методические рекомендации для обучающихся по организации и проведению учебной и производственных практик |
||
Методические рекомендации мр 1 0076/1-13 Издание официальное Москва,... Методические рекомендации предназначены для специалистов, проводящих обследование населения на маркеры вич-инфекции, специалистов... |
Методические рекомендации по выполнению внеаудиторных самостоятельных работ Методические рекомендации предназначены для студентов, обучающихся по специальностям |
||
Методические рекомендации Санкт-Петербург Принципы этиопатогенетической терапия острых фарингитов: Методические рекомендации / Составитель: С. В. Рязанцев. Спб.:, 32 с |
Жилищных и коммунальных услуг и обоснованности Методические рекомендации по расчету размера платы за жилищные услуги (далее Методические рекомендации) |
||
Методические рекомендации Санкт-Петербург Этиопатогенетическая терапия острых средних отитов: Методические рекомендации / Составитель св. Рязанцев. Спб.: 40 с |
Методические рекомендации по изучению дисциплины для студентов 1... Методические рекомендации предназначены для студентов, изучающих курс «Русский язык и культура речи». Методические рекомендации включают... |
Поиск |