Полиморфизм ДНК микобактерий, вызывающих неспецифические туберкулиновые реакции у сельскохозяйственных животных
|
Скачать 304.73 Kb.
|
На правах рукописиПЕРШИКОВА НАТАЛЬЯ ЛЕОНИДОВНА Полиморфизм ДНК микобактерий, вызывающих неспецифические туберкулиновые реакции у сельскохозяйственных животных 16.00.03 – ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология. Автореферат диссертации на соискание ученой степени к  андидата биологических наукНовосибирск 2008 Работа выполнена в ГНУ Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока СО Россельхозакадемии Научный руководитель: кандидат ветеринарных наук старший научный сотрудник Донченко Николай Александрович Официальные оппоненты: доктор биологических наук Глотова Татьяна Ивановна доктор ветеринарных наук, профессор Ощепков Владимир Григорьевич Ведущая организация: ГНУ Всероссийский научно-исследо- вательский институт пантового оленеводства СО Россельхозакадемии Защита состоится «__»___________2008 г. в «__» ч. на заседании диссертационного совета Д.006.045.01 при Государственном научном учреждении Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока СО Россельхозакадемии по адресу: 630501, Новосибирская обл., Новосибирский район, п. Краснообск, СО Россельхозакадемия, ИЭВСиДВ. С диссертацией можно ознакомиться в ЦНСХБ СО Россельхозакадемии Автореферат разослан «__»__________2008 г.  Учёный секретарь диссертационного совета, к.в.н. Г.М. Стеблева 1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Важным элементом в диагностике туберкулёза сельскохозяйственных животных является быстрая, чувствительная и специфическая идентификация этиологического фактора. Однако, так называемые, атипичные микобактерии усложняют постановку окончательной дифференциальной диагностики туберкулёза (А.И. Каграманов, 1964). Атипичные микобактерии, обитающие в окружающей среде и персистирующие в организме животных, сенсибилизируют его к ППД туберкулину для млекопитающих, что объясняется их антигенным родством с возбудителем туберкулёза (Ю.Я. Кассич, 1990). В результате чего затрудняется профилактический контроль благополучия стад крупного рогатого скота при проведении внутрикожной туберкулиновой пробы (Р.В. Костюк., 2004; А.Х.Найманов и др., 2004). При проведении эпидемиологического и эпизоотологического контроля различных инфекций, включая туберкулёз, важное место приобретают молекулярно-генетические данные (Г.Д. Каминский и др., 1989; В.В. Макаров и др., 1991). Для получения эпизоотологически значимых результатов необходимо проводить сравнение генетических данных, полученных в ходе исследования разных популяционных групп. Однако знание молекулярной вариабельности генома микобактерий только в одной группе носителей даёт недостаточно полные объективные данные для уточнения эпизоотической ситуации, но сравнение генетических структур популяций инфекционного патогена, выявленных на различных территориях, в разное время или у различных групп носителей, что может стать ключом к пониманию эволюционной истории микобактерий. Это позволит не только уточнить текущее разнообразие микобактериальных изолятов, циркулирующих в организме крупного рогатого скота, но и выделить исторические этапы эпизоотического процесса. Цель исследования – изучить генетический полиморфизм и особенности филогенетических и популяционных взаимоотношений популяции микобактерий, циркулирующих среди сельскохозяйственных животных (на территории Новосибирской области) при помощи молекулярно-генетических методов исследования. Для достижения цели были поставлены следующие задачи: 1. Провести подбор праймеров и оптимальных параметров проведения диагностической ПЦР, определить её чувствительность и специфичность. Тестировать референтные штаммы и изоляты микобактерий. 2. Изучить генетический полиморфизм культур, изолированных от животных, а также из объектов окружающей среды и грызунов благополучных и неблагополучных по туберкулёзу хозяйств. 3. Определить степень сходства изолированных культур микобактерий внутри изучаемой видовой выборки и в сравнении с прототипными штаммами. Научная новизна. Разработана диагностическая ПЦР, использующая в качестве мишени mig-ген M.avium, систему senX3-regX3 для дифференциации M.tuberculosis от M. bovis. Изучено генетическое разнообразие микобактерий. Получены данные по нуклеотидным последовательностям фрагмента mig-гена M. avium и системы senX3-regX3 M. tuberculosis complex. Определена степень сходства микобактерий с использованием популяционного и филогенетического методов исследования. Впервые от свиней на территории России выделен потенциально новый вид микобактерий M. arupense. Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты исследований представляют теоретическую и практическую ценность, поскольку позволяют расширить научные знания о генетическом полиморфизме и популяционных характеристиках микобактерий, циркулирующих среди сельскохозяйственных животных и могут быть использованы при проведении дифференциально-диагностических исследований на туберкулёз, а также при изучении молекулярной эпизоотологии болезни. Проведены подбор и тестирование олигонуклеотидных праймеров для детекции и дифференциации M. tuberculosis, M. bovis, M. avium, а также атипичных микобактерий. Доказана их эффективность для видоспецифичной экспресс-диагностики туберкулёза и проверена на ДНК 95 штаммов и изолятов различных видов микобактерий. Материалы диссертации использованы при составлении двух методических рекомендаций «Использование полимеразной цепной реакции со специфическими олигонуклеотидными праймерами для определения видовой принадлежности микобактерий», (Утв. подсекцией «Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии, протокол № 4, 2007) и «Применение ДНК-маркеров при генетическом картировании культур Mycoplasma species, Fusobacterium neccrophorum и Mycobacterium avium», (Утв. подсекцией «Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии, протокол № 1, 2008 г.). Апробация работы. Результаты работы доложены на заседаниях Учёного совета ГНУ Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока СО Россельхозакадемии (Новосибирск, 2003 – 2007 гг.), на научн.-практич. конф. «Информационные технологии, информационные измерительные системы и приборы в исследовании сельскохозяйственных процессов», (Новосибирск, 2003), II-й международ. научн.-практич. конф. молодых учёных (Новосибирск, 2006), на Российской науч.-практич. конф., посвящённой 110-летию кафедры инфекц. болезней Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова (Санкт-Петербург,2006), междунар. конф. молодых учёных (Омск, 2006 г), III Российской науч. конф. с международ. участием (Новосибирск, 2006), международ. конф. «Молекулярная биология 2007» (Москва, 2007). Публикации результатов исследований. По теме диссертации опубликованы 6 печатных работ, в том числе 1 статья в журнале, рекомендованном ВАК РФ («Сибирский вестник с.-х. науки»). Объём и структура диссертации. Работа изложена на 110 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов, выводов и списка литературы, включающего 190 источников, из них 108 на иностранных языках. Диссертация иллюстрирована 6 таблицами и 20 рисунками. Основные положения, выносимые на защиту: 1. Результаты подбора и тестирования олигонуклеотидных праймеров, используемых в ПЦР для выявления ДНК микобактерий. 2. Результаты изучения фрагмента гена 16S-23S рРНК потенциально нового вида микобактерий M. arupense. 3. Результаты изучения генетического полиморфизма, филогенетических и популяционных характеристик, выделенных изолятов как внутри группы, так и в сравнении с прототипными штаммами. 2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы Работа выполнена в лаборатории по разработке мер борьбы с туберкулёзом сельскохозяйственных животных ГНУ ИЭВС и ДВ СО Россельхозакадемии и на базе Института молекулярной биологии ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора. Анализ эпизоотической ситуации по туберкулёзу сельскохозяйственных животных проводили на основе отчетных данных Управления ветеринарии Администрации по Новосибирской области за период с 2000 по 2007 годы. В исследованиях использованы референтные штаммы, депонированные и предоставленные Федеральным Государственным учреждением Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов и культуры, изолированные от больных туберкулёзом и реагирующих на ППД туберкулин для млекопитающих животных, а также из объектов окружающей среды. Отбор, подготовка проб, постановка биопробы на лабораторных животных (морские свинки, кролики) и биохимические тесты проводили согласно «Наставлению по диагностике туберкулёза животных» (М., 2002). Поступивший в лабораторию биоматериал обрабатывали по методу А.П. Аликаевой и Гона-Левенштейна-Сумиоши. При окончательной постановке диагноза учитывали клинические признаки инфицированных животных и эпизоотологические данные хозяйств, откуда был завезён биоматериал. Выделение суммарной ДНК микобактерий из клинических образцов осуществляли методом фенольно-хлороформной экстракции (Т. Маниатис и др., 1984; А.В. Мазин и др., 1990) с предварительной обработкой лизирующим буфером. ДНК из чистых культур выделяли с применением сорбции на силикагеле с использованием набора ДНК-сорб (ЦНИИЭ). Всего исследовано 95 образцов ДНК различных видов микобактерий. Последовательности праймеров (табл. 1) заимствованы из источников литературы (J. Magdalena et al., 1998; M.L. Beggs et al, 2000; T. Adekambi et al., 2006; E. Alix et al, 2006; L. Xiong et al., 2006). Таблица 1- Праймеры для амплификации генома микобактерий.
В качестве маркеров выбраны: mig-gene, отвечающий за вирулентность M.avium, область senX3-regX3, характерная для M. tuberculosis complex, mgtC, отвечающий за вирулентность M.tuberculosis, 16S-23S rRNA – спейсерная последовательность для индикации всех видов типичных и атипичных микобактерий. ПЦР проводили в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 2,5 мкл буфера для Tag-ДНК-полимеразы, 2,5 мкл mM dNTP mix, по 2,5 мкл каждого праймера с концентрацией 2 mM, 2,5 ед. активности Tag-ДНК-полимеразы, 5 мкл ДНК. Поверх реакционной смеси наслаивали 20 мкл минерального масла. Постановку ПЦР осуществляли по общепринятым методикам на амплификаторе «Терцик» (А.Б. Вартапетян, 1991; Т.Д. Гришина и др., 1995; Б. Глик, Дж. Пастернак, 2002). Анализ, полученных в ПЦР данных, проводили методом электрофореза в агарозном геле. В качестве маркера использовали pUC19/Kzo9 I и pBluescript/Msp. Результаты электрофореза учитывали в УФ-свете на трансиллюминаторе с длиной волны 254 нм. Определение первичной нуклеотидной последовательности проводили на автоматическом секвенаторе «Beckman CEQ2000XL» («Beckman Coulter», США) cогласно инструкции производителя. Популяционный анализ осуществляли с использованием программ MEGA 3.1. (PSU, США) и GeneDoc 2.6. методом «ближайших соседей». Для построения дендрограммы использовали фрагменты нуклеотидных последовательностей микобактерий, депонированных в международной базе данных GenBank. Обработка последовательностей проводилась с использованием специализированных программных пакетов MEGA (PSU, США) и DNASTAR (DNAStar Inc., США). Дендрограммы построены на MegAlign 4.04. из пакета программ DNASTAR, Inc., Madison, USA. Для статистической обработки данных при оценке достоверности группирования применяли бутстреп-тест (Felseinstein, 1985). Автор выражает благодарность за участие в выполнении некоторых фрагментов диссертации к.б.н., сотруднику Института молекулярной биологии ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Терновому В.А.. 2.2. Результаты исследований
По данным статистической ветеринарной отчётности, в Российской Федерации за последние 15 лет наблюдается устойчивая положительная динамика снижения количества неблагополучных пунктов (как вновь выявляемых, так и остающихся на конец года) и количества заболевших туберкулёзом животных. Новосибирская область до настоящего времени ещё остаётся неблагополучной по туберкулёзу крупного рогатого скота, хотя и наблюдается тенденция к снижению заболеваемости животных. Так, на конец 2007 года было зарегистрировано 12 неблагополучных пунктов против 18 в 2000 году (рис. 1). Также произошло снижение реагирующих на ППД туберкулин для млекопитающих животных (с 5110 гол. в 2000 году до 1904 гол. в 2007). В биоценозах таких территорий была установлена циркуляция атипичных микобактерий: M. avium, M. smegmatis, M. phlei, M. arupense, M. terrae, M. fortuitum.  Рисунок 1 - Эпизоотическая ситуация по туберкулёзу КРС в хозяйствах Новосибирской области
С использованием вышеописанных методов исследовано 4 пробы, отобранные из объектов внешней среды (почва, вода, навоз, корма и т.д.), 88 проб биоматериала от крупного рогатого скота и свиней, а также биоматериал – от 3 птиц. Из данного биоматериала 10 (10,5 %) изолятов были идентифицированы как типичные микобактерии туберкулёза (4 – M.bovis, 6 – M. tuberculosis) и 85 (89,5 %) – атипичные микобактерии, из которых 2 относились к I группе по Раньону, 9 - ко II, 34 - к III и 20 - к IV группе по Раньону. Остальные пробы биоматериала неидентифицированы. 4 изолята, выделенные из почвы выгульной площадки, принадлежали к IV группе по Раньону. Из биоматериала, взятого от птиц в 2-х случаях микобактерии отнесли к III группе по Раньону. Один изолят остался недифференцированным (табл.2). 21 изолят, выделенный из биоматериала от реагирующих на туберкулин животных, идентифицировали до вида, из них 11 были определены как M. avium, 4 - как M. tuberculosis и 6 - как M. bovis. Таблица 2 - Культуры микобактерий, изолированные из биоматериала от животных и объектов внешней среды
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Похожие:
 |
1. назначение Наборы реагентов GenePak® dna pcr test предназначены для обнаружения ДНК возбудителей инфекционных заболеваний в биологических пробах... |
 |
Рабочая программа учебной дисциплины оптимизация рационов сельскохозяйственных... Учебно-методическое и информационное обеспечение дисциплины «Оптимизация рационов сельскохозяйственных животных с применением компьютерных... |
|
Инструкция по применению Амоксистина для профилактики и лечения сельскохозяйственных... Амоксистин антибиотик, водорастворимый порошок для орального применения. Предназначенный для лечения сельскохозяйственных животных... |
|
Правила содержания и выпаса сельскохозяйственных животных в мо «Город Братск» Правила разработаны с целью регламентации содержания на территории муниципального образования «Город Братск» сельскохозяйственных... |
|
В. Т. Сидоров стрессы у сельскохозяйственных животных москва во «агропромиздат» Основные виды стрессов и их влияние на здоровье и продуктивность животных |
|
1. Наименование Наименование объекта закупки – поставка автоматизированной системы для ускоренной детекции микобактерий туберкулеза и определения... |
|
Инструкция по применению «Энрофлокс 10%» порошка для лечения и профилактики... Энрофлокс 10% порошок для лечения сельскохозяйственных животных и птиц представляет собой комплект-упаковку порошкообразных веществ... |
|
Ионные реакции «ионые реакции», «ионы», «молекулярно-ионные уравнения», «реакции нейтрализации», «признак химической реакции» |
|
Лекция №3 Химическая кинетика Скорость реакции измеряется количеством вещества, реагирующего в единице объёма в единицу времени – (гомогенные реакции) или на единице... |
|
Инструкция по применению Энромика 10% раствора для инъекций для лечения... Энромик 10 раствор для инъекций (Enromic 10% injectable solution) антибактериальное лекарственное средство, предназначенное для лечения... |
|
Стандарт «Проведение мероприятий по предупреждению и ликвидации заразных и иных болезней животных, включая сельскохозяйственных, домашних,... |
|
Стандарт качества выполнения государственной работы Проведение мероприятий по предупреждению и ликвидации заразных и иных болезней животных, включая сельскохозяйственных, домашних,... |
|
Инструкция по организации и технологии работы станций и предприятий... Инструкция по организации и технологии работы станций и предприятий по искусственному осеменению сельскохозяйственных животных |
|
Отчет о текущей деятельности Госинспекции по ветеринарии нао с 30 мая по 05 июня 2016 года «Об утверждении порядка учета сельскохозяйственных животных на территории Ненецкого автономного округа» и «Об утверждении порядка... |
|
Тема: «Неблагоприятные (нежелательные) побочные реакции. Фармаконадзор.» Терминологию в области безопасности лс: нежелательные (неблагоприятные) побочные (лекарственные) реакции, побочные эффекты, нежелательные... |
|
Тема: Топология. Теория узлов Днк и, главным образом, и к нахождению условий, обеспечивающих образование замкнутых конфигураций ДНК |