Научные основы биотестирования с использованием инфузорий
|
Скачать 0.55 Mb.
|
|
На правах рукописи ВИНОХОДОВ Дмитрий Олегович НАУЧНЫЕ ОСНОВЫ БИОТЕСТИРОВАНИЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ИНФУЗОРИЙ 03.00.23 – биотехнология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Санкт-Петербург – 2007 Работа выполнена в государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Санкт-Петербургском Государственном технологическом институте (техническом университете) Научный консультант: доктор химических наук, профессор Гинак Анатолий Иосифович
Ведущая организация: Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия. Защита диссертации состоится 19 октября 2007 г. в 13-00 в аудитории №61 на заседании Диссертационного Совета Д 212.230.04 при Санкт-Петербургском Государственном технологическом институте (техническом университете). С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургского Государственного технологического института (технического университета). Замечания и отзывы по данной работе в 1 экземпляре, заверенном печатью, просим направлять по адресу: 1  90013, С.-Петербург, Московский пр., 26, Санкт-Петербургский Государственный технологический институт (технический университет), Ученый Совет.Автореферат разослан 3 сентября 2007 г. Ученый секретарь Диссертационного Совета Д 212.230.04, к. т. н., доцент Т. Б. Лисицкая ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Одним из важных направлений прикладной биотехнологии является разработка эффективных биологических методов оценки состояния разнообразных объектов внешней среды, загрязнение которых токсичными веществами в настоящее время приобрело комплексный характер. Даже если бы было возможно определить содержание всех ксенобиотиков в объекте исследования, такая информация была бы недостаточна для каких-либо прогнозов, так как токсикометрические параметры установлены лишь для незначительной части этих веществ. Кроме того, результат комбинированного действия двух и более токсичных веществ, имеющихся в исследуемом образце в небольших количествах, предсказать достаточно сложно. Соединения нетоксичные при изолированном действии могут вызывать значительный патологический эффект при комбинированном влиянии. Поэтому для оценки токсичности природных вод, промышленных сбросов, почвы, кормов и прочих объектов окружающей среды, а также новых химических веществ и внутренних сред организма человека и животных используют тесты на различных живых организмах. Предоставляя мало информации о природе поллютанта, биотестирование дает возможность с большой степенью достоверности определить степень интегральной токсичности объекта исследования. В числе организмов, на которых проводят биотестирование, присутствуют представители подцарства простейших. История применения Protozoa в качестве тест-организмов насчитывает не одно десятилетие. В то же время, развитие иных методов токсикологического анализа, таких как химические, физико-химические, иммунологические, а также использование биологической оценки на организмах из других систематических групп не снижают актуальности биотестов на простейших. Об этом говорит значительное число методических разработок, рекомендаций и публикаций, постоянно появляющихся в специализированных изданиях, а также их широкое использование на практике. Эти методы обладают высокой чувствительностью, экспрессностью, надежностью, универсальностью и малой себестоимостью. Они просты в проведении, поддаются инструментализации и автоматизации, а их результаты легко интерпретируемы. В отличие от химических и физико-химических методов анализа, биотестирование на инфузориях позволяет прогнозировать интегральное воздействие изучаемого объекта на живые организмы, поскольку реакция биологической тест-системы зависит не только от отдельных токсичных соединений, содержащихся в объекте исследования, но и от их взаимодействия между собой, а также от присутствия веществ, обладающих ярко выраженным влиянием на токсичность указанных соединений. А по сравнению с биотестами на высших животных оно обладает значительными преимуществами в экономической, методической и этической сферах. Хотя в рассматриваемой области накоплен богатый фактический материал, в биологической науке до сих пор отсутствует единая концепция, описывающая биотестирование на инфузориях. Определения основных используемых терминов не получили точных и исчерпывающих формулировок, недостаточно изучена культура инфузорий, как система, по реакции которой производится оценка объекта внешней cреды, не выявлены закономерности ее реакции на неблагоприятные воздействия, не сформулированы принципы выбора тест-организмов. Как следствие, отсутствуют единые методы подготовки проб и культуры инфузорий как тест-системы к проведению анализа. Недостаточность теоретического описания биотестирования на инфузориях влечет за собой разнообразные проблемы в практическом воплощении конкретных методик. Тест-организмы зачастую подбираются без учета их биологических особенностей, инфузории культивируют на нестандартных средах и в произвольных условиях, во многих методиках процесс подготовки тест-системы к анализу отсутствует как таковой, уровень чувствительности наблюдаемых тест-реакций далеко не всегда соответствует поставленным задачам, используемые для оценки степени проявления тест-реакции критерии в ряде случаев имеют малую информативность по сравнению с альтернативными. Все это приводит к огрублению результатов, неверной их интерпретации, снижению объективности выводов, а зачастую и к дискредитации биотестирования, как метода научного исследования. По этим причинам в настоящее время особую важность приобретает вопрос о комплексном подходе к биотестированию. В первую очередь необходим глубокий теоретический анализ этой группы методов. Создание единой концепции оценки свойств объектов окружающей среды по реакции культуры инфузорий должно способствовать развитию, стандартизации и унификации уже разработанных методов, а также созданию новых, более совершенных. Таким образом, можно заключить, что исследования в указанной области являются актуальными и имеют важное теоретическое и прикладное значение. Цель и задачи исследования. C учетом вышеизложенного в работе ставилась цель: на основе теоретического осмысления и критического анализа литературных данных и результатов собственных исследований сформировать научные основы биотестирования на инфузориях как метода научного исследования. Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи: 1 Обобщить и систематизировать накопленный опыт в области оценки свойств различных объектов по реакции организмов группы Protozoa; 2 Сформулировать определения основных терминов, используемых в биотестировании; 3 Сформировать научное представление о культуре инфузорий как диагностической тест-системе и выявить основные закономерности процесса ее взаимодействия с объектами исследования; 4 Разработать принципы выбора тест-организмов и методы подготовки культуры инфузорий к проведению биотеста применительно к конкретным задачам биотестирования различных объектов окружающей среды; 5 Сформировать комплекс мер для стандартизации процесса биотестирования и управления основными параметрами тест-систем; 6 Разработать эффективный, экспрессный, недорогой биотест с использованием инфузорий, отвечающий сформулированным требованиям, опробировать его в производственных условиях и внедрить в практику. Научная новизна. Обобщены и систематизированы исследования в области изучения реакций инфузорий на экстремальные химические воздействия, а также по их использованию в биотестировании. Разработана система терминов, используемых в области биотестирования. На основе комплексного представления о процессе биотестирования составлена его схема и рассмотрены основные факторы, влияющие на него. Проведено систематическое исследование процесса взаимодействия токсичных веществ и их смесей с культурой инфузорий на модели тест-реакций гибели и хемотаксиса. Выведены универсальные зависимости, описывающие этот процесс, получены параметры, численно характеризующие токсические свойства химических веществ и их смесей, а также состояние тест-системы. Показаны пути для оптимизации биотестирования и сформирован комплекс мер для его стандартизации и для управления основными характеристиками культуры инфузорий, как тест-системы. Предложены принципы выбора тест-организмов. В соответствии с ними выделен и предложен для научно-исследовательских работ и для практического использования штамм инфузории Colpoda steinii. Разработан и внедрен препарат для исcледования кормов в сельском хозяйстве на основе данного штамма. Разработана технология приготовления и налажено производство препарата. Все это позволило создать целостную концепцию биотестирования как метода научного исследования. Практическая ценность. Выделен, всесторонне охарактеризован и депонирован в коллекции микроорганизмов НИИ Особо чистых биопрепаратов производственный штамм инфузории Colpoda steinii П-1. Разработана и утверждена на уровне Министерства сельского хозяйства и продовольствия РФ, а также на уровне Министерства аграрной политики Украины научно-техническая документация на препарат "Культура Colpoda steinii сухая для эколого-токсикологических исследований": технические условия и наставление по применению. Разработанный метод оценки токсичности зернопродуктов включен в Межгосударственный стандарт ГОСТ 13496.7-97 "Зерно фуражное, продукты его переработки, комбикорма: Методы определения токсичности", Государственный стандарт Украины ДСТУ 3570-97 "Зерно фуражне, продукти його переробки, комбiкорми: Методи визначення токсичностi" и в Национальный стандарт Российской Федерации ГОСТ Р 52337-2005 "Корма, комбикорма, комбикормовое сырье: Методы определения общей токсичности" в качестве экспресс-метода. Совместно с редакцией журнала “Архив ветеринарных наук”, Всероссийским обществом протозоологов при РАН, Санкт-Петербургским государственным университетом и Международной академией информатизации организована и проведена Международная заочная научно-практическая конференция "Инфузории в биотестировании", Санкт-Петербург, 1998 г. В конференции приняли участие свыше ста специалистов из семи стран мира. Результаты исследований и теоретические обобщения, приведенные в диссертации, могут быть использованы в учебном процессе по учебным курсам, связанным с биотехнологией, экологией, зоологией беспозвоночных, протозоологией, производством сельскохозяйственных кормопродуктов и санитарией кормов. Апробация работы. Материалы работы доложены на следующих съездах, конференциях и заседаниях: - заседания Ветеринарного фармакологического совета при Главном управлении ветеринарии Министерства сельского хозяйства и продовольствия Российской Федерации, Москва, в 1992 и 1999 гг.; - Всероссийская конференция по совершенствованию мер профилактики и борьбы с микотоксикозами птиц, Ломоносов, Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт птицеводства, 1992 г.; - Международная конференция "Биотехнология-94", Санкт-Петербург, 1994 г.; - заседание Всероссийского общества протозоологов, Санкт-Петербург, 1998 г.; - Международная заочная научно-практическая конференция "Инфузории в биотестировании", Санкт-Петербург, 1998 г.; - заседание Международной молодежной научной школы "Биоиндикация-98", Петрозаводск, 1998 г.; - I съезд токсикологов России, Москва, 1998 г.; - Заочная научно-практическая конференция "Биотехнология в Федеральной целевой программе «Интеграция»", Санкт-Петербург, 1999 г.; - семинар "Контроль качества кормов" в Ленинградской областной ветеринарной лаборатории, Санкт-Петербург, 2000 г.; - III научно-техническая конференция аспирантов СПбГТИ(ТУ), Санкт-Петербург, 2000 г.; - Всероссийская научная конференция, посвященная 45-летию науч-но-исследовательской лаборатории питания и водоснабжения Военно-медицинской академии, Санкт-Петербург, 2001 г.; - Международная конференция молодых ученых "Химия и биотехно-логия биологически активных веществ, пищеваых продуктов и добавок. Экологически безопасные технологии", Тверь, 2002 г.; - Межвузовская конференция "Микотоксины в экосистемах Санкт-Петербурга и Ленинградской области", Санкт-Петербург, 2002 г.; - Всероссийская научно-практическая конференция "Гигиенические проблемы водоснабжения населения и войск", Санкт-Петербург, 2003 г.; - VII Вишняковские чтения. Стратегия и тактика вузовской науки в регионе, Бокситогорск, 2004 г.; - Всероссийская научно-техническая конференция "Успехи в специ-альной химии и химической технологии", Москва, 2005 г.; - IV съезд Общества биотехнологов России имени Ю.А. Овчинникова, Пущино, 2006 г. По пезультатам работы подготовлена и утверждена следующая научно-техническая документация: - Временное наставление к экспресс-методу определения токсичности кормов, кормовых добавок, воды и органов павших и убитых животных с использованием культуры Colpoda steinii. Утверждено Государственным департаментом ветеринарии МСХиП РФ. - Настанова по застосуванню культури Colpoda steinii (колпода) сухоi для еколого-токсикологiчних дослiджень об`ектiв зовнiшнього середовища тварин та птицi. Утверждена Гос. департаментом ветеринарной медицины МАП Украины. - Культура Colpoda steinii сухая для эколого-токсикологических исследований: Технические условия. ТУ 9388-001-885-95. Утверждены Государственным департаментом ветеринарии МСХиП РФ. - Культура Colpoda steinii суха для еколого-токсикологiчних дослiджень об`ектiв зовнiшнього середовища тварин та птицi: Технiчнi умови. ТУ У 46.15.243.-97. Утверждены Гос. департаментом ветеринарной медицины МСХиП Украины. Публикации. Основное содержание диссертации опубликовано в тридцати девяти работах, в том числе, монографии и четырнадцати статьях. По материалам работы получено четыре патента РФ. На основе оригинального метода биотестирования разработано три государственных стандарта: ГОСТ 13496.7-97, ДСТУ 3570-97 и ГОСТ Р 52337-2005. Объем и структура работы. Материалы диссертации изложены на 262 страницах машинописного текста и включают в себя введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты исследований, обсуждение, выводы и практические предложения. Материал иллюстрирован 20 таблицами и 41 рисунком. Список основной использованной литературы содержит 319 наименование работ отечественных и зарубежных авторов. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Понятия и определения Существенная часть нашей работы состоит в обсуждении вопросов терминологии, используемой в области биотестирования. Мы придаем этой проблеме особое значение, поскольку любая область науки, завершающая стадию формирования, должна получить связную и внутренне непротиворечивую систему понятий и определений. Биотестирование как метод исследования используют специалисты различных областей науки: в экологической токсикологии для анализа вод и почв, в гуманитарной и ветеринарной медицине для исследования свойств внутренних сред высших организмов, в сельском хозяйстве для экспресс-тестирования кормов на общую токсичность, в химии для первичной оценки свойств новых веществ и так далее. При этом само понятие "биотестирование" зачастую истолковывают по-разному, приспосабливая этот термин к тому или иному узкому кругу задач и объектов, тем самым, обедняя его содержание и даже вкладывая в него различный смысл. Еще сложнее обстоит дело с производными терминами в этой области знания - они не только не имеют устоявшихся определений, но зачастую даже не являются общепринятыми. Комплексное рассмотрение биологических тестов позволило нам вычленить их общие черты и составить универсальную формулировку определения, в котором преодолены проблемы узости сферы использования биотестирования и адекватности описания биологической основы, на которой проводится тест. Итак, биотестирование - это оценка свойств изучаемого объекта по его воздействию на биологическую тест-систему (далее - тест-систему) в стандартных условиях. Данная формулировка включает в сферу рассмотрения любые методы, в которых для изучения какого-либо явления используются биологические объекты. Это позволяет анализировать и сопоставлять биологические тесты, применяемые в разных областях, с единой точки зрения. Введение в данное определение понятия “тест-система” не является случайным. Как правило, для обозначения живого элемента, на котором производится постановка биологического теста используют иные понятия, такие как “тест-организм” и “тест-объект”. Между тем в общем случае мы имеем дело не просто с отдельными организмами, а с биологической системой, имеющей внутреннюю структуру, определяемую связями между ее биологическими элементами и средой, в которой они находятся. Эта система может состоять из группы организмов одного вида, сообщества нескольких видов, целой экосистемы, или же может включать отдельные органы и ткани организма, культуру клеток, изолированные органеллы, ферменты и т. д. Эти биологические элементы распределены в среде и заключены в определенном объеме. Именно тест-система, а не просто отдельные живые организмы, является центральным элементом процесса биотестирования, и уяснение сути этого термина дает ключ к научному пониманию процесса биотестирования, как такового, а следовательно, и к целенаправленному управлению им. Тест-система - это пространственно ограниченная совокупность чувствительных биологических элементов и среды, в которой они находятся. Из этой формулировки следует, что понятие “тест-объект” является составной частью понятия “тест-система” и органично включается в нее. Мы определяем этот термин следующим образом. Тест-объекты - это чувствительные элементы, входящие в тест-систему. Они могут находиться в одном или различных физиологических состояниях, их пространственное распределение может быть равномерным, или же они могут концентрироваться в каких-либо областях (на дне сосуда, на его стенках, на твердом носителе, у скоплений пищи и т. д.). Под термином же "тест-организм", который также достаточно часто используют специалисты, мы подразумеваем систематическое наименование тест-объекта вплоть до вида, штамма или клона. Принцип, лежащий в основе биотестирования как процесса преобразования материального потока в информационный, мы представляем в виде схемы, показанной на рис. 1.  Рисунок 1 – Принципиальная схема биотестирования Процесс постановки биологического теста начинается с того, что исследуемый образец переводят в состояние, удобное для проведения эксперимента, т. е. получают действующую форму, после чего осуществляют ее контакт с тест-системой. На тест-систему действует три группы факторов. Первая группа объединяет факторы исследуемого образца. К ним, например, относятся токсичные вещества, которые содержатся в исследуемом объекте. Воздействие факторов этой группы и подлежит оценке в процессе биотестирования, то есть является целевым. Вторая группа факторов объединяет различные посторонние воздействия и “шумовые” помехи. Это могут быть изменения температуры, освещения и прочих условий, которые сказываются на состоянии тест-системы. Эти факторы не всегда удается учитывать и устранять, тем не менее необходимо стремиться к минимизации их воздействия. К третьей группе факторов относятся разнообразные воздействия, которые наносят на тест-систему намеренно с целью регулирования ее чувствительности. Эти воздействия играют роль физиологической нагрузки и их применение может повысить чувствительность тест-систем на один-два порядка. В результате действия всех этих факторов тест-объекты и вся тест-система в целом претерпевают некоторую деформацию, что проявляется в изменении состояния тест-системы и появлении ряда реакций на различных уровнях ее функционирования. Эти реакции различаются по чувствительности, скорости проявления, легкости наблюдения и другим параметрам. Одну или несколько из этих реакций выбирают в качестве тест-реакции. Этот термин мы определяем следующим образом. Тест-реакция - это одна из закономерно возникающих ответных реакций тест-системы на воздействие комплекса внешних факторов, выбранная для анализа состояния этой тест-системы. По степени проявления тест-реакции судят о свойствах исследуемого образца. Определение степени проявления тест-реакции производится по некоторому критерию. При этом одной реакции может соответствовать несколько различных критериев. Например, исследуя тест-реакцию гибели организмов, можно регистрировать либо количество погибших особей за определенный промежуток времени, либо время, за которое погибает определенная часть задействованных в опыте животных. Тест-критерий - это показатель, на основании которого проводят оценку изменения состояния тест-системы, находящейся под воздействием комплекса внешних факторов. Таким образом, основной результат биотестирования, оценка свойств исследуемого объекта, зависит от ряда факторов: способа донесения действующего начала до тест-системы, характеристик самой тест-системы (вида тест-организмов, из которых состоит тест-система, их количества, состояния в момент тестирования и состава среды, в которой они находятся), комплекса посторонних воздействий, выбранной тест-реакции и способа ее наблюдения, тест-критерия и, наконец, от квалификации исследователя. Проведенные исследования позволили проанализировать эти факторы, а также составить рекомендации по стандартизации биологических тестов и целенаправленному управлению ими. Рассмотрим эти вопросы подробнее. |
Похожие:
 |
Конспект лекций по дисциплине «Научные основы производства продуктов питания» Конспект лекций по дисциплине «Научные основы производства продуктов питания» для студентов кафедры «Технология и организация общественного... |
|
Паблик рилейшнз: эволюция, научные основы, методология Написаны уже десятки книг на эту тему, публикуются статьи и материалы на страницах журналов и газет, создаются курсы, проводятся... |
 |
Научные записки Н 34 Научные записки мэбик за 2009 год. Сборник научных статей. Выпуск IX // Под ред. Н. Д. Кликунова, Курск: Изд-во Курского института... |
|
1. Образовательная деятельность Новосибирский техникум железнодорожного транспорта, научные центры с лабораториями, студенческие конструкторские бюро, самостоятельные... |
|
Дружининские чтения Научные основы экологического мониторинга водохранилищ: материалы всерос науч практ конф. Хабаровск, 28 февр. 3 марта 2005 г. – Хабаровск:... |
|
Предмет и научные основы системы государственного управления Содержание понятия государственного управления • Формы государственного устройства • Принципы и способы реализации государственной... |
|
Совершенствование организационно-экономического механизма ведения... Научные основы совершенствования организационно-экономического механизма ведения коневодства |
|
Эффективное взаимодействие микропроцессора и подсистемы памяти с... Кроме того, многие современные приложения, особенно научные, активно работающие с данными, часто не обеспечивают условий необходимых... |
|
1. Теоретические основы организации бд. Реляционная модель данных. 5 Проектирование реляционных баз данных с использованием семантических моделей: er-диаграммы 56 |
|
Инструкция внутримузейной передачи (на экспозиции, выставки, реставрацию,... Выдача предметов на реставрацию – согласно плану реставрационных работ. В случае производственной необходимости по разрешению директора... |
|
Методические рекомендации по изучению дисциплины м б. 1 Научные исследования... М б. 1 Научные исследования в профессиональной деятельности психолого-педагогического направления |
|
Программа дисциплины Основы работы в системе sap r3 для направления... Работа на практических занятиях (решение задач с использованием компьютеров, отчеты, обсуждения) |
|
Основная образовательная программа бакалавриата «Картография и геоинформатика» Геоинформационное обеспечение при создании единой картографической основы государственного кадастра недвижимости с использованием... |
|
Учебное пособие курс лекций по пм 03 мдк 03. 01 «Основы реаниматологии» «Основы реаниматологии» подготовлено в соответствии с утвержденной программой пм 03 «Оказание доврачебной медицинской помощи при... |
|
Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой... В рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы |
|
Конспект первых лекций по дисциплине “ основы автоматизированного... Основы компьютерного проектирования и моделирования радиоэлектронных средств” – объединены в одну дисциплину под названием “Основы... |