R14100210
Способ получения антитела, специфически связывающего домен димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu, в растении, антитело, полученное этим способом, и его применение
Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к биотехнологии, генной инженерии и медицине и может быть использовано для создания растений – суперпродуцентов антител, в частности против Her2/neu-позитивных раковых клеток. Настоящее изобретение может быть использовано для диагностики и лечения рака молочной железы.
Предшествующий уровень техники
Каждый год, рак молочной железы (РМЖ) убивает больше, чем 500 000 женщин во всем мире (WHO Position Paper on Mammography Screening, 2014). Примерно у 30% больных РМЖ, так называемых HER2-позитивных и наиболее опасных форм рака, наблюдается суперпродукция онкобелка HER2 (от Нuman Еpidermal growth factor Receptor 2), представляющего собой трансмембранную тирозиновую протеинкиназу ErbB2 с мол.массой 185 кДа. Аномальная активность HER2 вызывает ускоренное метастазирование и устойчивость к терапевтическому воздействию(Ahmed et al., 2015). Успех в лечении РМЖ связан с тем, что несколько лет назад в медицинскую практику был введен трастузумаб, созданный фирмой Дженентек (Genentech, США) и производимый фирмой Хоффман-Ля Рош (Hoffman La Roche, Швейцария). Это лекарство создано на основе гуманизированных моноклональных антител (МА) (huMab4D5-8 или rhuMabHer2), производимых мышиной гибридомой ATCC CRL-10463 из коллекции штаммов микроорганизмов и клеточных культур США (Hudziak et al., 1989) (Harries and Smith, 2002). Антитело, введенное в кровоток пациента, взаимодействует с внеклеточный частью HER2/neu и угнетает деление раковых клеток, редко сопровождающееся разрушением раковых клеток. В комбинации с химиотерапией антитела huMab4D5-8 оказывают выраженный лечебный эффект (Hudis, 2007). Показано, что использование трастузумаба снижает риск развития отдаленных метастазов и увеличивает продолжительность жизни пациентов (Hudis, 2007). Однако способ лечения трастузумабом имеет ряд недостатков. Обычно МА получают в культуре животных клеток, а это чаще всего опухолевые клетки яичника китайского хомячка (Chinese hamster ovary, CHO). Вообще, продукция белка в животных клетках сопряжена с риском контаминации продуктами и патогенами животного происхождения, такие как ретровирусы и прионы. Другим существенным недостатком является высокая стоимость МА, которая включает инновационные издержки, а также затраты на оборудование, систему поддержания стерильности, а также системы сертификации и контроля сред, использующих продукты животного происхождения и увеличивающих риск загрязнения препарата МА прионами и вирусами. Этим объясняется высокая стоимость лечения HER2/neu-позитивного РМЖ c использованием МА. Она составляет не менее 70 000 долларов США для лечения РМЖ с применением трастузумаба (Fleck, 2006)(Macedo et al., 2010).
Растение – это источник дешевого белка, имеющий ряд преимуществ по сравнению с клетками млекопитающих при использовании для продукции фармацевтических белков. Растения как «фабрики» (а) не содержат патогенных для человека вирусов и прионов, и (б) не требуют применения дорогостоящей аппаратуры (например, ферментеров), культуральных сред и поддержания стерильности. Стоимость выращивания исходных опытных растений несравнимо ниже стоимости культивирования клеток бактерий, дрожжей или животных. Технология «временной» продукции (transient expression) белков в растении позволяет наработать чужеродный белок в количестве, достигающем 10% - 30% от общего растворимого белка растения в короткое время (5-10 дней) (Komarova et al., 2010). Эта система успешно используется для продукции антираковых антител (Giritch et al., 2006). При использовании способа, когда целевой ген включается в бинарный вектор с последующей доставкой его в клетки инфицируемого растения методом агроинокуляции или агроинфильтрации, удалось получить в растении МА против онкогена Her2/neu, получившее название фитотрастузумаб (Komarova et al., 2011). У трастузумаба помимо высокой цены есть еще один недостаток, это появление при лечении РМЖ устойчивых к нему клеточных форм (Peake and Nahta, 2014). Одним из способов преодоления этой проблемы является создание антитела, способного узнавать другой, отличный от сайта узнавания трастузумабом, участок экзоклеточной части HER2 (Hu et al., 2014, p. 2)(Rimawi et al., 2015). Если трастузумаб взаимодействует с IV субдоменом (аминокислоты с 480 по 620), то поступивший недавно в клиническую практику пертузумаб, взаимодействуя со II субдоменом димеризации (аминокислоты с 165 по 310), блокирует димеризацию HER2 и HER3 (Barthélémy et al., 2014). Поскольку пертузумаб и трастузумаб блокируют HER2 в разных участках, то совместное использование этих антител приводит к синергидному эффекту (Kawajiri et al., 2015). Кроме того использование пертузумаба дает возможность лечения форм рака, резистентных к трастузумабу (Chung and Lam, 2013)(Rimawi et al., 2015).
Однако продукция пертузумаба имеет все те отмеченные выше недостатки, что и продукция трастузумаба.
Настоящее изобретения направлено на преодоление недостатков, присущих трастузумабу, фитотрастузумабу и пертузумабу, известным из уровня техники, путем продукции в клетке растения антитела, специфически, связывающего домен димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu.
Краткое описание изобретения
Первый аспект настоящего изобретения предусматривает рекомбинантный экспрессионный неамплифицирующийся вектор для получения в клетках растения легкой цепи антитела, специфически связывающего домен димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu, содержащий последовательно расположенные элементы: функционально активный в клетках растения промотор, нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:1, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3, состоящую из сигнального пептида, обеспечивающего секрецию антитела, и легкой цепи антитела, и терминатор транскрипции.
В предпочтительных вариантах воплощения промотор представляет собой промотор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты, промотор гена нопалин-синтетазы (nos), промотор гена октопин-синтетазы (ocs), промотор гена маннопин-синтетазы (mas) Agrobacteruim tumefaciens или промотор гена актин 2 Arabidopsis thaliana.
В предпочтительных вариантах воплощения терминатор транскрипции представляет собой терминатор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты, терминатор гена нопалин-синтетазы (nos), терминатор гена октопин- синтетазы (ocs), терминатор гена маннопин-синтетазы (mas) Agrobacteruim tumefaciens или терминатор гена актин 2 Arabidopsis thaliana.
В более предпочтительных вариантах воплощения промотор представляет собой промотор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты.
В более предпочтительных вариантах воплощения терминатор транскрипции представляет собой терминатор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты.
В наиболее предпочтительном варианте воплощения промотор представляет собой промотор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты и терминатор транскрипции представляет собой терминатор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты.
Второй аспект настоящего изобретения предусматривает рекомбинантный экспрессионный вирусный амплифицирующийся вектор для получения в клетках растения легкой цепи антитела, специфически связывающего домен димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu, содержащий последовательно расположенные элементы: функционально активный в клетках растения промотор, 5’-нетранслирумый участок генома Х-вируса картофеля, ген полимеразы X-вируса картофеля, второй промотор субгеномной РНК Х-вируса картофеля, нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:1, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3, состоящую из сигнального пептида, обеспечивающего секрецию антитела, и легкой цепь антитела, 3’-нетранслируемый участок генома Х-вируса картофеля и терминатор транскрипции.
В предпочтительных вариантах воплощения промотор представляет собой промотор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты, промотор гена нопалин-синтетазы (nos), промотор гена октопин-синтетазы (ocs), промотор гена маннопин-синтетазы (mas) Agrobacteruim tumefaciens или промотор гена актин 2 Arabidopsis thaliana.
В предпочтительных вариантах воплощения терминатор транскрипции представляет собой терминатор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты, терминатор гена нопалин-синтетазы (nos), терминатор гена октопин- синтетазы (ocs), терминатор гена маннопин-синтетазы (mas) Agrobacteruim tumefaciens или терминатор гена актин 2 Arabidopsis thaliana.
В более предпочтительных вариантах воплощения промотор представляет собой промотор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты.
В более предпочтительных вариантах воплощения терминатор транскрипции представляет собой терминатор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты.
В наиболее предпочтительном варианте воплощения промотор представляет собой промотор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты и терминатор транскрипции представляет собой терминатор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты.
Третий аспект настоящего изобретения предусматривает рекомбинантный экспрессионный вирусный амплифицирующийся вектор для получения в клетках растения легкой цепи антитела, специфически связывающего домен димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu, содержащий последовательно расположенные элементы: функционально активный в клетках растения промотор, 5’-нетранслирумый участок генома вируса табачной мозаики крестоцветных, ген полимеразы вируса табачной мозаики крестоцветных, включающий первый промотор субгеномной РНК вируса табачной мозаики крестоцветных, ген транспортного белка, включающий второй промотор субгеномной РНК вируса табачной мозаики крестоцветных, нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:1, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3, состоящую из сигнального пептида, обеспечивающего секрецию антитела, и легкой цепи антитела, 3’-нетранслируемый участок генома вируса табачной мозаики крестоцветных и терминатор транскрипции.
В предпочтительных вариантах воплощения промотор представляет собой промотор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты, промотор гена нопалин-синтетазы (nos), промотор гена октопин-синтетазы (ocs), промотор гена маннопин-синтетазы (mas) Agrobacteruim tumefaciens или промотор гена актин 2 Arabidopsis thaliana.
В предпочтительных вариантах воплощения терминатор транскрипции представляет собой терминатор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты, терминатор гена нопалин-синтетазы (nos), терминатор гена октопин- синтетазы (ocs), терминатор гена маннопин-синтетазы (mas) Agrobacteruim tumefaciens или терминатор гена актин 2 Arabidopsis thaliana.
В более предпочтительных вариантах воплощения промотор представляет собой промотор гена актин 2 Arabidopsis thaliana.
В более предпочтительных вариантах воплощения терминатор транскрипции представляет собой терминатор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты.
В наиболее предпочтительном варианте воплощения промотор представляет собой промотор гена актин 2 Arabidopsis thaliana и терминатор транскрипции представляет собой терминатор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты.
Четвертый аспект настоящего изобретения предусматривает рекомбинантный экспрессионный неамплифицирующийся вектор для получения в клетках растения тяжелой цепи антитела, специфически связывающего домен димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu, содержащий последовательно расположенные элементы: функционально активный в клетках растения промотор, нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:2, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4, состоящую сигнального пептида, обеспечивающего секрецию антитела, и тяжелой цепи антитела, и терминатор транскрипции.
В предпочтительных вариантах воплощения промотор представляет собой промотор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты, промотор гена нопалин-синтетазы (nos), промотор гена октопин-синтетазы (ocs), промотор гена маннопин-синтетазы (mas) Agrobacteruim tumefaciens или промотор гена актин 2 Arabidopsis thaliana.
В предпочтительных вариантах воплощения терминатор транскрипции представляет собой терминатор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты, терминатор гена нопалин-синтетазы (nos), терминатор гена октопин- синтетазы (ocs), терминатор гена маннопин-синтетазы (mas) Agrobacteruim tumefaciens или терминатор гена актин 2 Arabidopsis thaliana.
В более предпочтительных вариантах воплощения промотор представляет собой промотор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты.
В более предпочтительных вариантах воплощения терминатор транскрипции представляет собой терминатор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты.
В наиболее предпочтительном варианте воплощения промотор представляет собой промотор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты и терминатор транскрипции представляет собой терминатор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты.
Пятый аспект настоящего изобретения предусматривает рекомбинантный экспрессионный вирусный амплифицирующийся вектор для получения в клетках растения тяжелой цепи антитела, специфически связывающего домен димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu, содержащий последовательно расположенные элементы: функционально активный в клетках растения промотор, 5’-нетранслирумый участок генома Х-вируса картофеля, ген полимеразы X-вируса картофеля, второй промотор субгеномной РНК Х-вируса картофеля, нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:2, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4, состоящую из сигнального пептида, обеспечивающего секрецию антитела, и тяжелой цепи антитела, 3’-нетранслируемый участок генома Х-вируса картофеля и терминатор транскрипции.
В предпочтительных вариантах воплощения промотор представляет собой промотор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты, промотор гена нопалин-синтетазы (nos), промотор гена октопин-синтетазы (ocs), промотор гена маннопин-синтетазы (mas) Agrobacteruim tumefaciens или промотор гена актин 2 Arabidopsis thaliana.
В предпочтительных вариантах воплощения терминатор транскрипции представляет собой терминатор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты, терминатор гена нопалин-синтетазы (nos), терминатор гена октопин- синтетазы (ocs), терминатор гена маннопин-синтетазы (mas) Agrobacteruim tumefaciens или терминатор гена актин 2 Arabidopsis thaliana.
В более предпочтительных вариантах воплощения промотор представляет собой промотор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты.
В более предпочтительных вариантах воплощения терминатор транскрипции представляет собой терминатор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты.
В наиболее предпочтительном варианте воплощения промотор представляет собой промотор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты и терминатор транскрипции представляет собой терминатор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты.
Шестой аспект настоящего изобретения предусматривает рекомбинантный вирусный амплифицирующийся вектор для получения в клетках растения тяжелой цепи антитела, специфически связывающего домен димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu, содержащий последовательно расположенные элементы: функционально активный в клетках растения промотор, 5’-нетранслирумый участок генома вируса табачной мозаики крестоцветных, ген полимеразы вируса табачной мозаики крестоцветных, включающий первый промотор субгеномной РНК вируса табачной мозаики крестоцветных, ген транспортного белка, включающий второй промотор субгеномной РНК вируса табачной мозаики крестоцветных, нуклеотидная последовательность SEQ ID NO:2, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4, состоящую из сигнального пептида, обеспечивающего секрецию антитела, и тяжелой цепи антитела, 3’-нетранслируемый участок генома вируса табачной мозаики крестоцветных и терминатор транскрипции.
В предпочтительных вариантах воплощения промотор представляет собой промотор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты, промотор гена нопалин-синтетазы (nos), промотор гена октопин-синтетазы (ocs), промотор гена маннопин-синтетазы (mas) Agrobacteruim tumefaciens или промотор гена актин 2 Arabidopsis thaliana.
В предпочтительных вариантах воплощения терминатор транскрипции представляет собой терминатор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты, терминатор гена нопалин-синтетазы (nos), терминатор гена октопин- синтетазы (ocs), терминатор гена маннопин-синтетазы (mas) Agrobacteruim tumefaciens или терминатор гена актин 2 Arabidopsis thaliana.
В более предпочтительных вариантах воплощения промотор представляет собой промотор гена актин 2 Arabidopsis thaliana.
В более предпочтительных вариантах воплощения терминатор транскрипции представляет собой терминатор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты.
В наиболее предпочтительном варианте воплощения промотор представляет собой промотор гена актин 2 Arabidopsis thaliana и терминатор транскрипции представляет собой терминатор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты.
Седьмой аспект настоящего изобретения предусматривает способ получения антитела, специфически связывающего домен димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu, в растении, включающий стадии:
- обеспечение первого экспрессионного вектора, содержащего нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:1, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3, состоящую из сигнального пептида, обеспечивающего секрецию антитела, и легкой цепи антитела; где указанный экспрессионный вектор содержит следующие последовательно расположенные элементы: функционально активный в клетках растения промотор, нуклеотидная последовательность SEQ ID NO:1 и терминатор транскрипции;
- обеспечение второго экспрессионного вектора, содержащего нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:2, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4, состоящую из сигнального пептида, обеспечивающего секрецию антитела, и тяжелой цепи антитела; где указанный экспрессионный вектор содержит следующие последовательно расположенные элементы: функционально активный в клетках растения промотор, нуклеотидная последовательность SEQ ID NO:2 и терминатор транскрипции;
-получение штамма Agrobacterium tumefaciens, трансформированного первым экспрессионным вектором, и штамма Agrobacterium tumefaciens, трансформированного вторым экспрессионным вектором;
- совместное введение штамма Agrobacterium tumefaciens, трансформированного первым экспрессионным вектором, и штамма Agrobacterium tumefaciens, трансформированного вторым экспрессионным вектором, в клетки растения рода Nicotiana;
- культивирование полученного растения и сбор листьев;
- выделение и очистка антител из собранных листьев.
В предпочтительном варианте воплощения первый экспрессионный вектор представляет собой рекомбинантный экспрессионный неамплифицирующийся вектор согласно первому аспекту настоящего изобретения и второй экспрессионный вектор представляет собой рекомбинантный экспрессионный неамплифицирующийся вектор согласно четвертому аспекту настоящего изобретения.
В предпочтительном варианте воплощения первый экспрессионный вектор представляет собой рекомбинантный вирусный амплифицирующийся вектор на основе X-вируса картофеля согласно второму аспекту настоящего изобретения и второй экспрессионный вектор представляет собой рекомбинантный вирусный амплифицирующийся вектор на основе вируса табачной мозаики крестоцветных согласно шестому аспекту настоящего изобретения.
В предпочтительном варианте воплощения первый экспрессионный вектор представляет собой рекомбинантный вирусный амплифицирующийся вектор на основе вируса табачной мозаики крестоцветных согласно третьему аспекту настоящего изобретения и второй экспрессионный вектор представляет собой рекомбинантный вирусный амплифицирующийся вектор на основе X-вируса картофеля согласно пятому аспекту настоящего изобретения.
В предпочтительных вариантах воплощения растение выбирают из Nicotiana benthamiana, Nicotiana tabacum, Nicotiana excelsior.
В наиболее предпочтительном варианте воплощения растение представляет собой Nicotiana benthamiana.
В предпочтительных вариантах воплощения растения культивируют в почве в условиях теплицы или климатической камеры со световым режимом: день 16 часов, ночь 8 часов.
Восьмой аспект настоящего изобретения предусматривает антитело, специфически связывающее домен димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu, полученное заявленным способом.
Девятый аспект настоящего изобретения предусматривает применение заявленного антитела, специфически связывающего домен димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu, в качестве терапевтического агента для лечения HER2/neu-позитивного рака молочной железы.
В предпочтительных вариантах воплощения применение дополнительно включает введение второго терапевтического агента, ингибирующего активность HER2/neu.
В более предпочтительных вариантах воплощения вторым терапевтическим агентом является ингибитор тирозинкиназы.
В наиболее предпочтительном варианте воплощения ингибитор тирозинкиназы представляет собой лапатиниб.
В более предпочтительных вариантах воплощения второй терапевтический агент представляет собой антитело, взаимодействующее с экзоклеточной частью онкобелка HER2/neu.
В наиболее предпочтительном варианте воплощения второй терапевтический агент представляет собой антитело трастузумаб.
В наиболее предпочтительном варианте воплощения второй терапевтический агент представляет собой антитело фитотрастузумаб.
Десятый аспект настоящего изобретения предусматривает применение заявленного антитела, специфически связывающего домен димеризации экзоклеточной части онкобелка HER2/neu, при изготовлении лекарственного средства для лечения HER2/neu-позитивного рака молочной железы.
|
