Федеральное государственное автономное образовательное учреждение
высшего профессионального образования
"Казанский (Приволжский) федеральный университет"
На правах рукописи
Сабирзянова Алсу Зуфаровна
Цитотоксичность и генотоксичность
антител к ДНК СЫВОРОТОК КРОВИ
БОЛЬНЫХ СИСТЕМНЫМИ АУТОИММУННЫМИ ЗАБОЛЕВАНИЯми
в культуре мононуклеарных клеток крови здоровых лиц
03.01.04 – биохимия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Казань – 2012
Работа выполнена на кафедре биохимии Казанского (Приволжского)
федерального университета
Научный руководитель:
|
кандидат биологических наук, доцент
Невзорова Татьяна Александровна
|
Официальные оппоненты:
|
доктор медицинских наук
Мустафин Ильшат Ганиевич
|
|
кандидат биологических наук
Уразов Наиль Гумерович
|
Ведущая организация:
|
ГБОУ ДПО «Казанская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (г. Казань)
|
Защита состоится « 16 » февраля 2012 г. в 13 часов на заседании Диссертационного Совета Д 212.081.08 при Казанском (Приволжском) федеральном университете по адресу:
420008, г. Казань, ул. Кремлевская, д. 18, главное здание, аудитория 211.
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке имени Н.И. Лобачевского Казанского (Приволжского) федерального университета.
Автореферат разослан « » января 2012 г.
У ченый секретарь Диссертационного Совета,
д октор биологических наук, профессор Абрамова З.И.
Общая характеристика работы
Актуальность проблемы
Аутоиммунные заболевания (АИЗ) – это заболевания, возникающие вследствие гиперактивности иммунной системы, дисбаланса во взаимодействии ее звеньев и нарушения толерантности к молекулам собственного организма (Ройт, 2007).
Общим признаком АИЗ является гиперглобулинемия и избыточное образование широкого спектра ААТ (Насонов и Сура, 1988). Аутоантитела (ААТ) – это антитела (АТ), способные взаимодействовать хотя бы с одним аутоантигеном (антигеном собственных тканей).
При некоторых аутоиммунных патологиях, а также других заболеваниях и физиологических состояниях, таких как стресс, беременность наблюдается повышение содержания в крови больных аутоантител класса IgG к нативной ДНК (IgG-ААТ к нДНК), происхождение и биологическая роль которых на сегодняшний день остаются невыясненными.
Системная красная волчанка (СКВ) и ревматоидный артрит (РА) – это хронические тяжелые системные аутоиммунные заболевания с неясной этиологией и обширной картиной иммунопатогенеза.
Характерное повышение уровня IgG-ААТ к нДНК в крови больных СКВ является одним из диагностических критериев данного заболевания. Российскими учеными было обнаружено, что АТ к ДНК при СКВ обладают ДНК-гидролизующей активностью (Gabibov et al., 1994).
РА – распространенное АИЗ, поражающее 0,5–2% взрослого населения в работоспособном возрасте 35–55 лет (Каратеев, 2007). Было показано, что приблизительно у 25% пациентов с РА наблюдаются повышенный уровень АТ с ДНК-гидролизующей активностью (Suchkov, 2001; Gabibov et al., 2006).
СКВ и РА снижают качество и продолжительность жизни населения, поэтому входят в число важных биомедицинских и социальных проблем современности. К сожалению, с каждым годом число больных СКВ и РА возрастает (Арлеевская и др., 2010; Невзорова и Винтер, 2006).
Вероятно, развитие АИЗ является следствием сочетания многих факторов, среди которых необходимо выделить наследственную предрасположенность, гормональный статус человека и негативное воздействие физико-химических и биологических факторов окружающей среды. Согласно литературным данным, риск развития аутоиммунной патологии у родственников больных АИЗ в 2 раза выше, чем в остальной популяции (Silman and Pearson, 2002). Вместе с тем ранняя диагностика СКВ и РА является сложной задачей, так как симптомы часто неспецифичны и могут наблюдаться при широком спектре как ревматических, так и неревматических заболеваний.
В связи с этим важной задачей биохимии является разработка подходов и методов диагностики, прогнозирования течения патологического процесса, контроля эффективности комплексной терапии и мероприятий профилактики АИЗ.
Для решения поставленной проблемы необходим поиск и анализ маркера, обладающего свойствами, специфичными для разных АИЗ, и отражающего изменение иммунного статуса человека задолго до развития полномасштабной картины патологического аутоиммунного процесса.
В ряде работ показано, что активность АИЗ (в частности, СКВ) не всегда коррелирует с уровнем ААТ к ДНК (Villalta et al., 2009; Becker-Merok et al., 2006). У многих пациентов с СКВ в период устойчивой ремиссии заболевания и отсутствии клинического синдрома сохраняется высокий уровень ААТ к ДНК по сравнению с нормой. Кроме того, повышенный уровень ААТ к ДНК наблюдается и при других АИЗ, например, РА с клиническими проявлениями, отличными от СКВ. Это наводит на мысль, что не только и не столько уровень, а в большей мере свойства ААТ к ДНК определяют течение патологического процесса при развитии АИЗ и могут различаться при разнообразных аутоиммунных патологиях.
ААТ к ДНК, вероятно, являются участниками патологического процесса, но их роль в развитии и течении СКВ, РА и других АИЗ представляется исследователям неоднозначной.
Большинство авторов поддерживают мнение о патогенетической роли гетерогенной популяции ДНК-связывающих и ДНК-гидролизующих ААТ класса IgG в аутоиммунитете (Reefman et al., 2007; Jacob et al., 2006; Isenberg et al., 2007; Kowal et al., 2004; Невзорова, 2005). Но не исключено, что ААТ к нДНК, как часть пула естественных ААТ, в норме выполняют защитную функцию, способствуя удалению трансформированных и пораженных вирусами клеток, аутоантигенов, образующихся при разрушении тканей, и поддерживая гомеостаз организма (Полетаев и Чурилов, 2009).
В исследованиях последних лет показано, что некоторые ААТ к ДНК способны не только связывать растворимые антигены и рецепторы на поверхности клеток, но и проникать через мембрану внутрь клеток, взаимодействовать с органоидами и локализоваться в ядре, влияя на метаболические процессы (Yanase and Madaio, 2005; Rivadeneyra-Espinoza and Ruiz-Argüelles, 2006; Jang et al., 2009).
Предположительно, IgG-ААТ к нДНК могут быть индукторами и участниками аутоиммунного синдрома, приводя к нарушению апоптоза клеток, следствием чего является увеличение содержания апоптотических телец и времени их циркуляции в кровотоке, что часто наблюдается при СКВ и является, по крайней мере, одной их причин утраты аутотолерантности иммунной системы (Lorenz et al, 2000).
И до сих пор среди исследователей нет единого мнения о роли поликлональных IgG-ААТ к нДНК в нарушении баланса клеточной гибели при развитии СКВ и РА.
Целью работы явилось исследование влияния антител класса IgG к нативной ДНК при системной красной волчанке и ревматоидном артрите на мононуклеарные клетки здоровых лиц in vitro.
Были поставлены задачи:
Оценить влияние антител к ДНК сывороток крови доноров, больных системной красной волчанкой на стадии обострения и в период ремиссии заболевания, больных ревматоидным артритом и клинически здоровых родственников больных ревматоидным артритом на мононуклеарные клетки здоровых лиц in vitro;
Изучить зависимость влияния антител класса IgG к нативной ДНК на жизнеспособность и метаболизм мононуклеарных клеток in vitro от заряда молекулы антител и аффинности к нативной ДНК;
Оценить генотоксичность и влияние антител класса IgG к нативной ДНК в норме и при системных аутоиммунных заболеваниях на уровень апоптоза мононуклеарных клеток здоровых лиц in vitro.
Научная новизна
Впервые на первичной культуре мононуклеарных клеток здоровых лиц показано, что патогенетический потенциал поликлональных антител класса IgG к нативной ДНК может быть обусловлен изменением их физико-химических и иммунохимических свойств (суммарного заряда молекулы и аффинности к нативной ДНК) при развитии аутоиммунной патологии и отличается в разных группах системных аутоиммунных заболеваний.
Показано, что высокоочищенные свободные от иммунных комплексов антитела класса IgG к нативной ДНК здоровых доноров и больных СКВ на стадии обострения заболевания оказывают сходное влияние на мононуклеарные клетки периферической крови здоровых лиц in vitro. Обнаружено, что положительно заряженные антитела класса IgG к нативной ДНК больных СКВ в активной стадии заболевания обладают более выраженной цитотоксичностью и генотоксичностью по сравнению с антителами доноров.
Поликлональные антитела класса IgG к нативной ДНК больных СКВ в период ремиссии заболевания не оказывают значимого влияния на мононуклеарные клетки здоровых лиц in vitro.
Показано, что наряду с положительно заряженными низкоаффинными антителами, характерными для доноров и больных СКВ на стадии обострения заболевания, высокоаффинные антитела класса IgG к нативной ДНК больных ревматоидным артритом проявляют цитотоксичность и генотоксичность в культуре мононуклеарных клеток здоровых лиц in vitro.
Влияние субфракций антител класса IgG к нативной ДНК клинически здоровых родственников больных ревматоидным артритом сходно с влиянием антител больных ревматоидным артритом.
Поликлональные антитела класса IgG к нативной ДНК при системных аутоиммунных заболеваниях приводят к повышению уровня апоптоза мононуклеарных клеток здоровых лиц in vitro.
Практическая значимость
Изучение свойств антител класса IgG к нативной ДНК в культуре мононуклеарных клеток крови здоровых лиц способствует более глубокому пониманию фундаментальных основ работы иммунной системы человека в норме и при патологии. Материалы исследования представляют интерес в области биохимии, молекулярной биологии, иммунологии и могут быть использованы в учебном процессе высших учебных заведений на биологических и медицинских факультетах.
Изменение свойств антител класса IgG к нативной ДНК в норме, при различных аутоиммунных заболеваниях, а также на разных стадиях активности патологического процесса, проявляющееся в воздействии антител на мононуклеарные клетки здоровых лиц, является специфическим маркером, отражающим изменение иммунного статуса, что может быть использовано для создания тест-системы выявления нарушений работы иммунной системы человека.
Практическая значимость работы определяется возможностью использования субфракций антител класса IgG к нативной ДНК в качестве инструмента, позволяющего диагностировать, прогнозировать развитие и течение, проводить мониторинг состояния больных аутоиммунными заболеваниями и оценивать эффективность терапии с использованием культуры клеток.
Апробация работы
Основные результаты исследований докладывались на Всероссийской Конференции с элементами научной школы для молодежи «Структура и динамика молекулярных систем» (Казань, 2009), Научно-практической конференции биохимиков, посвященной памяти профессора В.Г. Винтера «История и достижения Казанской биохимической школы» (Казань, 2009), XIII европейском симпозиуме студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз-2009» (Казань, 2009), I Всероссийской виртуальной интернет-конференции «Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологии» (Казань, 2010), I и II Международных научно-практических конференциях «Новые концепции механизмов воспаления, аутоиммунного ответа и развития опухоли» (Казань, 2010, 2011).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 9 научных работ, в том числе 2 публикации в рецензируемых изданиях, рекомендованных действующим перечнем ВАК.
Структура и объем диссертации
Диссертационная работа изложена на 121 странице и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов с 24 рисунками, 3 таблицами и обсуждения полученных результатов, выводов и списка цитируемой литературы со 131 наименованием.
Положения, выносимые на защиту
Механизм цитотоксичности ДНК-связывающих и ДНК-гидролизующих антител класса IgG в культуре мононуклеарных клеток здоровых лиц связан с нарушением структуры ДНК хроматина клеток;
Цитотоксичность и генотоксичность антител класса IgG к нативной ДНК зависит от их физико-химических и иммунохимических свойств. Изменение свойств антител класса IgG к нативной ДНК отражает нарушения в иммунной системе при аутоиммунных заболеваниях;
Антитела класса IgG к нативной ДНК вносят отрицательный вклад в развитие аутоиммунных заболеваний, приводя к повышению уровня апоптоза здоровых иммунокомпетентных клеток крови человека.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Выделение антител класса IgG к нативной ДНК из сывороток крови человека
Выделение и все этапы очистки субфракций антител класса IgG к нативной ДНК (IgG-АТ к нДНК) проводили по ранее разработанной методике (Невзорова, 2005). В работе были использованы образцы крови лиц женского пола: 20 образцов крови здоровых доноров (21-72 лет), 7 – больных СКВ на стадии обострения заболевания (24-76 лет), 8 – больных СКВ в период ремиссии заболевания после гормональной терапии (35-40 лет), 20 образцов крови больных РА (31-79 лет) и 20 – клинически здоровых родственников больных РА (40-65 лет), полученные из медицинских учреждений г. Казани. Диагноз СКВ и РА был поставлен квалифицированными ревматологами.
Исследование влияния IgG-АТ к нДНК на клетки in vitro
Выделение МНК, лимфоцитов и моноцитов из крови человека
Мононуклеарные клетки (МНК) из свежезабранной крови здоровых лиц выделяли по стандартной методике на фиколл-верографине – плотность 1.077 мг/мл (Metcalf et al., 1985).
Культивирование клеток с АТ к ДНК
Клетки (МНК/моноциты/лимфоциты) инкубировали в трех повторах в 96- / 24-луночном планшете («Linbro», Шотландия) (37ºС, 5% СО2) с АТ к ДНК сывороток / субфракциями IgG-АТ к нДНК. К 160 мкл клеток (2•104 клеток/лунку) в полной среде RPMI-1640 («Gibco», Шотландия), pH 7,4, содержащей 2 мМ глутамина («Serva», Германия), 100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 200 мкг/мл гентамицина, 10% эмбриональной бычьей сыворотки, добавляли АТ до конечной концентрации 1 мкг/мл, подобранной экспериментально. Контрольные образцы вместо АТ к нДНК содержали ФСБ (отрицательный контроль) и панкреатическую дезоксирибонуклеазу I (3 ед/мл – положительный контроль («Serva», Германия)), так как патологические АТ к ДНК проявляют ДНК-гидролизующую активность.
Исследования влияния АТ к нДНК на клетки проводили через 72 часа инкубации при 37ºС, 5% СО2 – время инкубации было подобрано экспериментально.
Для исследования количества клеточного белка, уровня апоптоза, повреждения ДНК МНК, выделения Н2О2 моноцитами клетки собирали и 4 раза отмывали от среды холодным ФСБ с последующим центрифугированием (200g, 4 минуты).
Исследование общего количества и количества жизнеспособных клеток
По окончании времени культивирования клетки аккуратно собирали при 0°С и оценивали общее количество и количество жизнеспособных клеток методом исключения трипанового синего (0,3% раствор красителя на ФСБ) в камере Горяева.
Определение концентрации клеточного белка
Концентрацию белка в клетках определяли колориметрически (методом Бредфорда). Результаты выражали в нанограммах белка в расчете на одну клетку (Остерман, 1981).
Определение количества потребления глюкозы клетками
Концентрацию глюкозы в среде до и после инкубации клеток определяли колориметрическим глюкозоксидазным методом, используя стандартный коммерческий набор реагентов («Агат», Россия). Результаты поглощения глюкозы клетками выражали в % от содержания глюкозы в полной среде до инкубации.
Определение продукции перекиси водорода моноцитами
Концентрацию перекиси водорода, выделяемой моноцитами после инкубации с АТ к нДНК, определяли колориметрически по окислению фенолового красного пероксидазой хрена (Pizato et al., 2006). Результаты выражали в наномолях в расчете на одну клетку.
Оценка повреждения ДНК клеток методом флуоресцентной спектрофотометрии
Степень повреждения ядерной ДНК определяли по изменению интенсивности флуоресценции комплекса этидий бромид-ДНК хроматина клеток (Анисимов и Болотников, 1999).
Оценка уровня повреждения клеточной ДНК методом «ДНК-комет»
В микроцентрифужные пробирки с 240 мкл 1% агарозного геля («Fermentas», Канада, Тпл < +42 °С) вносили 60 мкл клеточной суспензии, содержащей не менее 105 клеток. В качестве положительного контроля для визуализации деградации ДНК использовали клетки, инкубированные 5 минут при -20°С в присутствии 100 мкМ Н2О2.
На предметное стекло (+37°С), покрытое полилизином («ApexLab», Россия), наносили 60 мкл полученного агарозного геля с клетками, равномерно распределяли и оставляли на 30 минут для полимеризации геля.
После полимеризации геля предметные стекла помещали в лизирующий раствор (10 мM трис-HCl, pH 10, 2,5 M NaCl, 100 мM ЭДТА-Na2, +4°С, 1% Triton X-100, 5% ДМСО). Лизис клеток проводили в течение 1 часа при 4°С, после чего стекла переносили в электрофорезный буфер (300 мM NaOH, 1 мM ЭДТА-Na2, pH>13, +4°С) на 20 минут. Электрофорез проводили 20 минут при 1 В/cм. По окончании электрофореза стекла переносили в 70% раствор этилового спирта на 15 минут для фиксации, после чего микропрепараты высушивали при 20°С в течение 1-2 часов.
Препараты окрашивали акридиновым оранжевым (20 мкг/мл) 30 минут и анализировали на флуоресцентном микроскопе (AxioScope A1 «Сarl Zeiss», Германия) с соответствующими фильтрами (возбуждающий фильтр 490 нм, дихроичное зеркало 510, отсекающий фильтр 530 нм), увеличение 40х (Marlin et al, 2004; Hartmann et al, 2004; McKelvey-Martin et al, 1997; Speit et al, 2006; Morley et al., 2006).
При визуальном анализе подсчитывали 30-50 «ДНК-комет», затем их ранжировали на пять условных типов с соответствующим для каждого числовым значением от 0 до 4. Степень поврежденности ДНК при этом выражали как индекс «ДНК-комет» (ИДК), определяемый по формуле:
|
