I. Методы выделения сперматозоидов из нативного эякулята человека

Скачать 238.46 Kb.

Название	I. Методы выделения сперматозоидов из нативного эякулята человека
страница	2/2
Тип	Документы

rykovodstvo.ru > Руководство эксплуатация > Документы

1 2

II. определение экстернализации

фосфатидилсерина
Особым видом гибели клетки (ГК), при котором внешние или внутренние сигналы дают импульс клетке к образованию или активации ферментов, приводящих её к самоуничтожению, является апоптоз (от греч. apoptosis – опадание, листопад).

Апоптоз играет важную роль в регуляции сперматогенеза – сложного многостадийного процесса образования сперматозоидов из первичных половых клеток, который начинается в период половой зрелости и продолжается в течение всей жизни (Плосконос М.В., 2014в).

В норме апоптоз не должен затрагивать эякуляторные сперматозоиды, так как их предназначение – не выполнение функции в пределах определённого срока, а формирование нового организма, продолжение жизни. Однако эякуляторные сперматозоиды могут проявлять признаки апоптоза (Плосконос М.В., 2014б; 2015а).

Обычно апоптоз протекает в две стадии: первая – стадия активации биохимических процессов, вторая – необратимые морфологические изменения.

Одно из самых ранних биохимических изменений, происходящих в клетке подвергшейся апоптозу – нарушение структуры её мембраны, что проявляется в перемещение фосфатидилсерина (ФС) на её внешнюю сторону (экстернализация). Это является сигналом для фагоцитоза и распознается рецепторами ФС, присутствующими на поверхности фагоцита (Плосконос М.В., 2013, 2015в).

В живых клетках мембрана характеризуется наличием структурной асимметрии локализации различных фосфолипидов по отношению к внутренней и внешней сторонам мембраны. Фосфатидилхолин и сфингомиелин располагаются на наружной поверхности, а фосфатидилсерин преимущественно на внутренней, обращенной к цитозолю поверхности.

Поддержание фосфолипидной асимметрии клеточной мембраны – одно из непременных условий жизнедеятельности клеток. Преимущественная локализация различных классов фосфолипидов на внутренней или внешней сторонах цитоплазматической мембраны, определяется специфическими ферментами, например, аминофосфолипидтранслоказой, которая транспортирует ФС во внутренний слой мембраны. Известно, что физиологический уровень цитоплазматического кальция необходим для сбалансированной работы флоппазы и аминофосфолипидтранслоказы.

При инициации апоптоза активность транслоказы в большинстве типов клеток млекопитающих (исключение составляют клетки некоторых опухолевых линий) подавляется. Одним из механизмов данного процесса является возрастание концентрации внутриклеточного Ca²⁺, что приводит к накоплению ФС в наружном слое мембраны.

Таким образом, ФС – фосфолипид, который в процессе апоптоза локализуется на клеточной поверхности и формирует один из специфических сигналов для распознавания апоптотической клетки фагоцитами и элиминации апоптозных телец (Плосконос М.В., 2015б; Эмануэль В.Л., 2013).

Для определения экстернализации ФС используется «аннексиновый» метод, основанный на способности протеина Annexin V, принадлежащего к группе аннексинов, избирательно связываться с отрицательно заряженным ФС в присутствии ионов кальция (рисунок).

Рисунок. Изменение мембранной локализации фосфатидилсерина, ассоциированное с апоптозом, и связывание белка Аннексина-V в присутствии ионов кальция
Аннексин-V – кальцийзависимый белок (35-36 kDa), обладающий высокой аффинностью к ФС (K_d,~5×10^-2) (Эмануэль В.Л., 2013).

В неповрежденную клетку Annexin V не проникает. Утрата мембраной асимметрии предшествует другим наблюдаемым изменениям клетки — нарушению целостности мембраны, фрагментации ДНК и конденсации хроматина и может служить ранним маркером апоптоза.

Для анализа сперматозоидов используют Annexin V конъюгированный с различными флюорохромами, например флюоресцеином (FITC), фикоэритрином (PE) и другими.

Поскольку при нарушении целостности мембраны ФС, локализованный на внутренней стороне мембраны, становится доступным для связывания с Annexin V, для выявления и исключения некротических / разрушенных клеток в анализируемую систему вводят дополнительный краситель, не проникающий через целую мембрану, а проникающий только в погибшие клетки, например йодид пропидия (PI) или 7-аминоактиномицин D (7-AAD) (Плосконос М.В., 2013, 2014а). Для анализа используется проточная цитометрия или флуоресцентная микроскопия.

Таким образом, например, при анализе сперматозоиды, не помеченные ни Annexin V, ни PI, считаются интактными (живыми), т.е. (AnV-/PI-)-сперматозоиды.

Сперматозоиды, помеченные только Annexin V, — апоптическими, т.е. (AnV+/PI-)-сперматозоиды (ранний апоптоз).

Поздняя фаза апоптоза, формирование апоптозных телец, сопровождается не только формированием мембранной асимметрии, но и резким возрастанием проницаемости мембраны для катионных красителей. Клетки, находящиеся в позднем апоптозе, и частично некротические клетки (вторичный некроз) идентифицируются как помеченные Annexin V и PI, т.е. (AnV+/PI+)-сперматозоиды. Мёртвые клетки с поврежденной мембраной (некротические клетки) могут также быть помеченные только PI, т.е. (AnV-/PI+)-сперматозоиды.

Экстернализация ФС, выявляемая с помощью аннексина-V–FITC, визуализируется в виде зелёной флуоресценции. У сперматозоидов зелёная флуоресценция наблюдается вокруг головки, средней части, и некоторых частей хвоста сперматозоидов, в то время как окрашивание катионным красителем PI головки сперматозоида проявляется в виде красной флуоресценции и указывает на повреждение целостности мембраны.

Зная число окрашенных апоптотических и некротических клеток, можно рассчитать индекс апоптоза: соотношение апоптотических и живых неокрашенных клеток (Lachaud С., 2004).

Достоинствами метода окрашивания сперматозоидов комбинацией аннексин-V–FITC и PI является — простота и быстрота исполнения; минимальное число манипуляций, повреждающих клетки; возможность выделить интактные, апоптические и мёртвые клетки; совместимость с одновременным маркированием поверхностных антигенов.

Среди отмечаемых недостатков — при использовании метода необходимо соблюдение однообразных условий постановки реакции, т.к. от этого в значительной мере зависит воспроизводимость метода. Для получения надёжных результатов следует строго соблюдать одинаковые интервалы от момента взятия биологического материала до получения отмытых клеток, окрашивания и анализа. Это связано с тем, что клетки могут отвечать инициацией апоптоза или некрозом при длительной инкубации в неоптимальной для выживания среде, при воздействии факторов, повреждающих клеточную мембрану, и прочее, что приведёт к нарастанию содержания апоптотирующих и некротических клеток, т.е. возможно получение искаженных результатов при неосторожном обращении с клетками (повреждается мембрана). Необходимо также строго соблюдать температурный режим окрашивания и концентрацию реагентов.

В настоящее время существует множество наборов, содержащих готовые реагенты (Annexin V-FITC Kits, Annexin V-FLUOS Staining Kit, Annexin V-FITC/7-ADD Kit, Annexin V Apoptosis Detection Kit I (BD) и др., для проточной цитометрии или флюоресцентной микроскопии.
Методика окрашивания сперматозоидов аннексином-V-FITC и PI:

Для обнаружения экстернализации ФС «аннексиновым» методом можно использовать наборы реагентов Annexin V-FITC Fluorescence Microscopy Kit (BD, Biosciences Pharmingen, San Diego, USA) и Propidium Iodide (BD, USA или Sigma, Великобритания).

Реактивы

1. Аннексин V-FITC в водном буферном растворе (50 мМ Трис, рН 8,0, 80 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА) с содержанием бычьего 0,2% сывороточного альбумина (БСА) и 0,09% азида натрия.

2. 10Х кратный фосфатно-солевой буфер (PBS) (1,4 М NaCl, 27 мМ КCl, 100 мМ КН₂РО₄/К₂НРО₄ (рН 7,5)).

3. 10Х кратный Аннексин V «связывающий буфер» (0,1 М Hepes/NaOH (рН 7,4), 1,4 М NaCl, 25 мМ CaCl₂.

4. Йодид пропидия PI в концентрации 50 мкг/мл в фосфатно-солевом буфере (рН 7,4).

Реактивы хранят в холодильнике при температуре 4°C, не допуская замораживания и длительного воздействия света. Рабочие растворы (1X) получают растворением 1 части 10X аннексин-V «связывающего» буфера или 10X PBS буфера с 9 частям дистиллированный воды.

Клетки окрашивают аннексином V-FITC и PI, согласно инструкции изготовителя с некоторыми модификациями:

1. Сперматозоиды отмывают дважды 1Х PBS. Для этого часть эякулята (100-200 мкл) смешивают (1:10) с 1Х PBS и центрифугируют при 220 g в течение 10 мин. После центрифугирования надосадок удаляют шприцем, а к осадку добавляют 1Х PBS, ресуспендируют и далее центрифугируют при тех же условиях. Отбирают необходимое кол-во клеток (1×10⁶/мл).

2. После удаления надосадка сперматозоиды отмывают в 5 мл 1X аннексин-V «связывающего» буфера путём центрифугирования при 220 g в течение 10 мин. Полученный надосадок удаляют.

3. Для окрашивания осадок клеток ресуспендируют в 500 мкл 1X «связывающего» буфера, содержащего 5 мкл аннексин V-FITC и 10 мкл раствора PI (конечная концентрация 1 мкг/мл) и инкубируют 15 мин в темноте при комнатной температуре.

4. Отмывают сперматозоиды один раз в 5 мл 1X «связывающего» буфера путём центрифугирования при 220 g в течение 10 мин.

5. Добавляют дополнительно «связывающий буфер», после чего суспензию клеток спермы наносят мазком на стеклянную пластинку и высушивают на воздухе. Мазки исследуют на флуоресцентном микроскопе МИКРОМЕД 3 ЛЮМ (Санкт-Петербург) под иммерсионным объективом ×100. В каждом мазке рассматривают как минимум 500 сперматозоидов. Отношение количества окрашеных клеток к общему количеству клеток в тесте выражают в процентах.

Результаты оценивают следующим образом: неокрашенные (AnV-/PI-)-сперматозоиды оценивают как жизнеспособные. (AnV+/PI-)-сперматозоиды, т.е. окрашенные только аннексином-V – как ранние апоптотические. (AnV+/PI+)-сперматозоиды, т.е. окрашенные и аннексином-V и PI – как поздние апоптотические (или вторичный некроз). (AnV-/PI+)-сперматозоиды, т.е. окрашенные только PI – как некротические.

Индекс апоптоза (ИА) рассчитывают как отношение между живыми окрашенными (AnV+/PI-)-клетками и общим количеством живых неокрашенных (AnV-/PI-)-клеток:
И

А = Количество в % (AnV+/PI-)-сперматозоидов

Количество в % (AnV-/PI-)-сперматозоидов

Список литературы

Воробьёва О.А., Семёнова Е.В., Филатов М.В. Оценка методом проточной цитофотометрии эффективности очистки сперматозоидов в программе ЭКО. Актуальные вопросы физиологии и патологии репродуктивной функции женщины. В кн.: Материалы XXIV научной сессии НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта РАМН. 1995: 53-54.
Воробьёва О.А., Воскресенская А.В., Одинцов А.А., Филатов М.В. Мужское бесплодие и нарушение структурной организации хроматина сперматозоидов. Существует ли связь? Проблемы репродукции. 2005; 6: 56-62.
Леонтьева О.А., Воробьёва О.А. Сравнительный анализ морфологии сперматозоидов человека: нативный эякулят – прогрессивно подвижная фракция. Проблемы репродукции. 1999; 3: 29-36.
Плосконос М.В. Методы определения апоптоза сперматозоидов (Обзор литературы). Клиническая лабораторная диагностика. 2013; 4: 3-8.
Плосконос М.В. Применение эозина и йодистого пропидия для оценки жизнеспособности сперматозоидов человека. Клиническая лабораторная диагностика. 2014а; 59 (11): 22-25.
Плосконос М.В., Николаев А.А. «Абортивный» апоптоз сперматозоидов: какова его доля в эякуляте фертильного мужчины. Проблемы репродукции. 2014б; 20 (6): 70-75.
Плосконос М.В. Николаев А.А. Апоптоз и мужская фертильность. Врач. 2014в; 3: 23-25.
Плосконос М.В. Взаимосвязь нарушения симметрии клеточной мембраны сперматозоидов и нарушения фертильности у мужчин. Проблемы репродукции. 2015а. 21: 4: 125-128.
Плосконос М.В. Экстернализация фосфатидилсерина на поверхность мембран сперматозоидов под действием оксидативного стресса. Российский иммунологический журнал. 2015б; 9(18): 1(1): 156 – 157.
Плосконос М.В. Биохимические изменения в мембране сперматозоидов фертильных мужчин под воздействием индуктора оксидативного стресса и коррекция этих изменений. Проблемы репродукции. 2015в; 21: 5:102-108.
Эмануэль В.Л., Мнускина М.М., Смирнов А.В. и др. Аннексин-5 – биохимический маркёр ранних сосудистых нарушений при хронической болезни почек. Клиническая лабораторная диагностика. 2013; 4: 9-10.
Aynaud O., Poveda J.-D. Frequence of herpes simplex virus, cytomegalovirus and human papillomavirus DNA in semen. J. Androl. 2001; 1: 141-142.
Cassuto N.G., Sifer C., Naouri M. et al. Screening of hepatitis C virus (HCV) in the different fractions of semen from infected infertile men. Hum. Reprod. 2001; 16: 139.
Chen S.U., Ho H.N., Chen H.F. Comparison between a two-layer discontinuous Percoll gradient and swim-up for sperm preparation on normal and abnormal semen samples. Assist. Reprod. Genet. 1995; 12 (10): 698-703.
Florence L.H.Ng, De Yi Liu, Gordon Baker H.W. Comparison of Percoll and swim-up methods for sperm preparation from abnormal semen samples. Hum. Reprod. 1992; 2: 261-266.
Gandini L., Lombardo F., Paoli D. Full-term pregnancies achieved with ICSI despite high levels of sperm chromatin damage. Hum. Reprod. 2004; 6: 1409-1417.
Lachaud С., Tesarik J., Canadas M.L., Mendoza C. Apoptosis and necrosis in human ejaculated spermatozoa. Hum. Reprod. 2004; 19 (3): 607-610.
Marina F., Alcolea R., Exposito R., et al. Special semen-washing technique as a safe method for using assisted-reproduction techniques in HIV-1 seropositive men. Hum. Reprod. 1998; 15: 155-156.
Morrell J.M., Sakkas D., Moffatt O., et al. Reduced senescence and retained chromatin integrity in human sperm prepared by density gradient centrifugation. J. Androl. 2001; Suppl (Abstr P5/6): 34.
Mortimer D. Sperm Preparation Methods. J. Androl. 2000; 21: 357-366.
Neftel K.A., Muller M.R., Walti M. Penicillin-G degradation products inhibit in vitro granulopoiesis. Br. J. Haematol. 1983; 54: 255-260.
Paasch U., Grunewald S., Dathe S., Glander HJ. Mitochondria of human spermatozoa are preferentially susceptible to apoptosis. Ann. N.Y. Acad. Sci. 2004; 1030: 403-409.
Prakash P., Leykin L., Chen Z. et al. Preparation by differential gradient centrifugation is better than swim-up in selecting sperm with normal morphology (strict criteria). Fertil Steril. 1998; 69: 722-726.
Sakkas D., Manicardi G.C., Tomlinson M. The use of two density gradient centrifugation techniques and the swim-up method to separate spermatozoa with chromatin and nuclear DNA anomalies. Hum. Reprod. 2000; 15 (5): 1112-1116.
Singer R., Fish B., Levinsky H. Separation of human semen on Percoll gradients: effect on percentage of motile and morphologically normal sperm and proportion of acrosome reacted sperm. Int. J. Fertil Menopausal Stud. 1995; 37: 3: 161-166.
Spano M., Cordeli E., Leter G. Nuclear chromatin variations in human spermatozoa undergoing swim-up and cryopreservation evaluated by the flow cytometric sperm chromatin structure assay. Mol. Hum. Reprod. 1999; 5: 29-37.
Strehler E., Baccetti B., Sterzik K. et al. Detrimental effects of polyvinylpyrrolidone on the ultrastructure of spermatozoa (Notulae seminologicae 13). Hum. Reprod. 1998; 13: 120-123.
Van Der Zvalmen P., Bertin Segal G., Geerts L. Sperm morphology and IVF pregnancy rate: comparison between Percoll gradient centrifugation and swim-up procedures. Hum. Reprod. 1991; 4: 581-588.
Younglai E.V., Holt D., Brown P. et al. Sperm swim-up techniques and DNA fragmentation. Hum. Reprod. 2001; 16: 1950-1953.

1 2

	«Руководство воз по лабораторному исследованию и обработке эякулята... Спермограмма (при патоспермии необходимо предоставить не менее двух спермограмм )		«Руководство воз по лабораторному исследованию и обработке эякулята... Спермограмма (при патоспермии необходимо предоставить не менее двух спермограмм )
	Сегментация томографических изображений грудной клетки человека для... Сегментация томографических изображений грудной клетки человека для автоматизированного выделения и визуализации тромбов		Инструкция по применению питательного агара для выделения листерий палкам ...
	Инструкция по применению питательного агара для выделения листерий пал ...		Анкета оценки нервно-психической устойчивости «прогноз» Лвма им. С. М. Кирова и предназначена для первоначального выделения лиц с признаками нервно-психической неустойчивости. Она позволяет...
	Инструкция по применению набора реагентов для бактериологических исследований Набор реагентов для бактериологических исследований «Питательный агар для культивирования и выделения возбудителя бруцеллёза сухой...		Методические рекомендации приемы психологической саморегуляции Часть... Представлены способы саморегуляции эмоциональных состояний; упражнения, направленные на концентрацию внимания, работу с тонусом мышц...
	Фармакология (наука о лекарственных средствах и их применении) и... Лекарственные средства (медикаменты, фармакологические препараты) это растительные, животные или химические вещества (или препараты),...		Методы диагностики одержания человека Признаки одержания и состояния ж. М. По глазным проявлениям. Некоторые внеглазные признаки этих состояний 9
	Тема современные методы системных исследований Основные направления социологических исследований. Методы, используемые в рамках социологических исследований. Методологическая стратегия...		Курс-конспект лекций и контрольные задания Рига 2006. Методическое... Современная психодиагностика определяется как психологическая дисциплина, разрабатывающая методы выявления и изучения индивидуально...
	Лекция № «Роль семьи в жизни человека. Планирование семьи. Укрепление... Систематизировать и закрепить знания студентов по данной теме, овладеть умениями и навыками высчитывания плодных дней, регистрации...		1 Понятие бжд, опасности. Классификация опасности бжд научная дисциплина,... Опасность – явления, процессы, объекты, способные в определенных условиях наносить ущерб здоровью человека
	Отраслевой дорожный методический документ методы Методы укрепления откосов земляного полотна автомобильных дорог засевом трав в различных климатических зонах		Методические рекомендации по изучению дисциплины «Методы исследований... Целью освоения дисциплины «Методы исследования в социальной работе» является формирование целостной системы знаний об основных общенаучных...

I. Методы выделения сперматозоидов из нативного эякулята человека

Похожие: