I. Методы выделения сперматозоидов из нативного эякулята человека
|
Скачать 238.46 Kb.
|
1 2
|
СОДЕРЖАНИЕ I. Методы выделения сперматозоидов из нативного эякулята человека……………………….....5 1. Метод отмывания сперматозоидов от семенной плазмы…...……………………………………………….........................8 2. Метод центрифугирования эякулята в градиенте плотности….…………………………………………………………….....8 3. Метод «swim-up»……………….................................................13 4. Сравнение метода «swim-up» и метода центрифугирования эякулята в градиенте плотности……………..........................15 II. определение экстернализации фосфатидилсерина …………………………………………………..21 Список литературы……………………...........................30 Список сокращений
I. Методы выделения сперматозоидов из нативного эякулята человека Эякулят – порция сперматозоидов и спермоплазмы, выделяющаяся из уретры во время одной эякуляции. При проведении научных и лабораторных исследований, а так же при селекции половых клеток с целью дальнейшего их использования в программах вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) бывает необходимо отделение половых клеток от спермоплазмы. Для выделения сперматозоидов из нативного эякулята существует несколько методов: метод отмывания от семенной плазмы, метод всплытия «swim-up» и метод центрифугирования эякулята в градиенте плотности. Другие методы обработки спермы, например, методы фильтрации (в колонках из стекловолокна, стеклянных гранул или поперечно-сшитого декстранового геля), используются крайне редко в силу их неоправданной трудоёмкости. Важным условием при выборе того или иного метода является сохранение жизнеспособности и кинетических параметров мужских половых клеток после их выделения, а при выделении сперматозоидов с целью их селекции для программ ВРТ необходимым является получение фракции прогрессивно подвижных форм сперматозоидов с нормальной структурой хроматина. Ключевым моментом при выделении сперматозоидов является то, что сперма должна быть подготовлена в течение одного часа после получения. Достаточно часто применяется метод отмывания, в результате которого нативный эякулят разделяют на сперматозоиды и семенную плазму центрифугированием при 1700 g, отмывая сперматозоиды дважды физиологическим раствором. Paasch U. и соавт. (2004) после разведения эякулята в 0,9 % NaCI (1:1) отмывание выполняли центрифугированием при 400 g в течение 5 мин. Lachaud С. и соавт. (2004) в своём исследовании отмывание сперматозоидов проводили в фосфатно-солевом буфере (PBS; pH=7,4) (1:10) путём центрифугирования при 220 g в течение 10 мин. Метод отмывания – самый простой метод и для подготовки сперматозоидов к программам ВРТ применяется чаще всего к эякуляту хорошего качества. При этом проводится однократная или двойная отмывка сперматозоидов культуральной средой с последующим центрифугированием. К недостаткам метода принято относить образование активных форм кислорода в осадке клеток после центрифугирования, а так же оседание вместе с подвижными сперматозоидами потенциально токсичных клеток и мертвых сперматозоидов, что может оказывать негативный эффект и сказываться на сохранности генетического материала жизнеспособных сперматозоидов. Одним из наиболее важных факторов для определения вероятности успеха в ВРТ и нормального развития эмбриона является качество половых клеток. Плохо подготовленные сперматозоиды не позволят получить эмбрионы хорошего качества. Успешное оплодотворение и дальнейшее полноценное развитие эмбриона возможно только при условии нормальной структуры хроматина сперматозоидов. Стандартные процедуры определения функционально-морфологических параметров сперматозоидов, например, подвижность сперматозоидов, поддаются экспресс-анализу под световым микроскопом, но хорошие параметры не всегда соответствуют хорошей оплодотворяющей способности спермы или возможности обеспечивать дальнейшее развитие в зиготу. Полноценность спермального хроматина не может быть оценена методом быстрой световой микроскопии. Поэтому важно использовать такую технологию обработки спермы, которая гарантированно позволит отобрать функционально активные сперматозоиды с нормальной структурой хроматина из общей имеющейся в наличии популяции. Так, одним из направлений оптимизации программы экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) является разработка методов, позволяющих с наибольшей эффективностью выделить из эякулята фракцию прогрессивно подвижных сперматозоидов, используемую для инсеминации ооцитов, которая имела бы наилучшие показатели кинематики и морфологии. Поэтому наиболее широко применяемыми в программах ВРТ и в большинстве андрологических лабораторий для получения подвижной фракции является метод всплытия «swim-up», либо фракционирование эякулята в градиенте плотности (технология обработки спермы «Percoll» или «PureSperm»). 1. Метод отмывания сперматозоидов от семенной плазмы Методика отмывания сперматозоидов заключается в следующем: 1. Часть эякулята после разжижения смешивают (1:10) с фосфатно-солевым буфером (PBS; pH=7,4) и центрифугируют при 220 g в течение 10 мин. 2. Семенную плазму удаляют, а осадок ресуспендируют в 1 мл среды Menezo B-2 (BioMerieux, France). 3. После этого небольшую часть (100 мкл) этой клеточной взвеси отбирают для оценки жизнеспособности, качества, различных биохимических маркёров сперматозоидов, а остальную часть взвеси можно в экспериментальных целях либо инкубировали в среде В-2 с 5% СО2 при 37°С в течение разного времени, либо подвергать воздействию различных факторов. 2. Метод центрифугирования эякулята в градиенте плотности Центрифугирование спермы в градиенте плотности позволяет отобрать подвижные сперматозоиды с нормальной морфологией. Метод основан на принципе центрифугирования спермы через градиент, образованный, двумя-тремя слоями растворов с возрастающей плотностью (масса/объём), содержащих различные концентрации частиц коллоидного кремния. Таким образом, подход основан на разделении компонентов (клеток) эякулята по их удельному весу и плотности. При выполнении метода градиентного центрифугирования образец эякулята располагается поверх градиента. При центрифугировании различные клетки занимают определенное положение, в котором их плавучая плотность соответствует плотности градиента. Разделение основано на том, что зрелые сперматозоиды имеют плотную упаковку ДНК и большую плотность, чем 80% раствор, поэтому проходят сквозь него и оседают на дне пробирки. Сперматозоиды, получаемые со дна пробирки, обладают наибольшей подвижностью. Градиентное центрифугирование применяется многими лабораториями IVF, как штатный способ обработки спермы низкого качества. Технология центрифугирования сперматозоидов в градиенте плотности была впервые разработана в 1996 г. с использованием в качестве коллоида «Percolltm» («KABI Pharmacia», Швеция). Его применение было ограничено производителем только для исследовательских целей. В лабораторных условиях растворы перколла готовят на HBS + BSA буфере с рН 8,0 (0,13 М NaCl, 0,004 М KCl, 0,001 М CaCl2, 0,0005 М MgCl2, 0,014 М фруктозы, 0,01 М N-2-гидроксиэтилпиперазин-N-2-этансульфоновой кислоты и 1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина). Lachaud С. и соавт. (2004) в своём исследовании сперматозоиды из эякулята выделял центрифугированием в градиенте плотности перколла (40 – 80%) при 200 g в течение 20 мин, после чего Percoll был заменён Hams F-10 (Sigma, St Louis, MO) с добавлением 1%-ного бычьего сывороточного альбумина и 25 мМ HEPES (рН=8,0) (Sigma). 40% фракции было удалено, а более плотный слой был повторно ресуспендирован в 10 мл PBS и снова центрифугирован при 600 g в течение 10 мин. Полученный осадок был ресуспендирован в 1 мл среды Menezo B2 (BioMerieux, France). Для клинического использования в качестве материала для выделения сперматозоидов из спермы методом центрифугирования в градиенте плотности применяется «PureSperm» («Nidacon International AB», Швеция). «PureSperm» состоит из коллоидного раствора двуокиси кремния в сбалансированном растворе солей, забуференном HEPES. Производитель рекомендует двухслойный градиент, включающий 40 и 80% PureSperm, который можно создавать за счёт разбавления PureSperm буфером PureSperm Buffer или применять готовые к использованию PureSperm 40 и PureSperm 80 («Nidacon International AB», Швеция). Для достижения наилучших результатов градиент следует готовить непосредственно перед использованием и подогреть до комнатной температуры. Методика выделения сперматозоидов из эякулята методом центрифугирования в градиенте плотности с использованием «PureSperm» заключается в следующем: 1. Инкубируют сперму при 37°C в течение 30 минут для разжижения; 2. Подготавливают два градиента: например 1,5 мл 40% компонента и 1,5 мл 80% компонента в пробирке с коническим дном; 3. Разжиженный эякулят осторожно, не нарушая разделение слоев, что может понизить эффективность сепарации, наслаивают на градиент; 4. Центрифугируют при 300 g в течение 20 мин. После центрифугирования на дне конической центрифужной пробирки образуется осадок из наиболее подвижной фракции сперматозоидов; 5. Пастеровской пипеткой осторожно удаляют семенную плазму, а также верхнюю интерфазу, 40% слой и нижнюю интерфазу. Оставляют основную часть 80% слоя. 6. Чистой стерильной пастеровской пипеткой, погруженной в 80% слой, аспирируют осадок, ресуспендируют его в буфере для гамет и переносят в чистую центрифужную пробирку для отмывания остатков коллоидного раствора. 7. Центрифугируют 10 мин при 600 g. 8. Повторяют отмывку с буфером для гамет. 9. Удаляют супернатант и ресуспендируют в небольшом объёме среды для приготовления сперматозоидов или среды для оплодотворения. 10. Подсчитывают количество сперматозоидов и вычисляют концентрацию. При необходимости делают разведение. Хранят в инкубаторе с 6% CO2 при 37°С. При правильном выполнении вышеописанной методики, осадок содержит только функционально активные подвижные сперматозоиды, которые могут быть использованы для процедур ВРТ (внутриматочной инсеминации (ИСМ/ИМД), ЭКО или интрацитоплазматической инъекции сперматозоида (ИКСИ)). Сравнительный анализ технологий обработки спермы «Percoll» и «PureSperm» показывает, что последняя технология обладает некоторыми преимуществами перед «Percoll», что даёт возможность для её клинического использования. Во-первых, Percolltm состоит из частиц двуокиси кремния, связанных с поливинилпиролидоном (ПВП) в воде, и к нему необходимо добавлять специальный солевой раствор перед использованием. PureSperm содержит силансвязанные частицы двуокиси кремния в HEPES-забуференном сбалансированном растворе солей, который поддерживает жизнеспособность сперматозоидов во время центрифугирования. Во-вторых, содержание ПВП в Percolltm служит причиной субмикроскопических изменений. Известно, что его использование для замедления движения сперматозоидов перед процедурой ИКСИ вызывает несвоевременную деконденсацию спермального хроматина и снижение процента оплодотворения. В-третьих, присутствие HEPES в качестве буфера в PureSperm оказывает антиоксидантное действие. PureSperm в процессе производства стерилизуется автоклавированием и имеет очень низкий уровень эндотоксинов. Percolltm не может быть автоклавирован и имеет значительные колебания в содержании эндотоксинов от партии к партии, что приводит к невозможности использования некоторых партий для обработки сперматозоидов. 3. Метод «swim-up» Метод всплытия «swim-up» или флотация довольно часто используемый метод миграции сперматозоидов. Подход имитирует естественное перемещение сперматозоидов через цервикальную слизь. При этом фракция спермы располагается под фракцией культуральной среды, что позволяет прогрессивно подвижным сперматозоидам переместиться во фракцию среды. К недостатку метода «swim-up» следует отнести неадекватность подхода при выраженной астенозооспермии (низкой подвижности сперматозоидов). Выделение сперматозоидов данным методом можно осуществлять либо из нативной спермы, в результате чего подвижные сперматозоиды из центрифугированного осадка выходят в верхнюю фазу, в наслоенную чистую среду, либо лучше сначала отмыть сперматозоиды и ресуспендировать осадок перед последующим выделением спермиев всплытием. Для вязкого образца спермы можно сделать предварительное разведение со средой для сперматозоидов. Методика выделения сперматозоидов из нативной спермы методом всплытия «swim-up» с использованием среды ReadySwimtm («Nidacon International AB», Швеция) заключается в следующем: 1. В центрифужной пробирке на аликвоту разжиженного эякулята наслаивают среду для метода «swim-up» ReadySwimtm ; 2. Пробирку ставят в термостат под углом примерно в 45°. Инкубируют в течение 1 ч при 37 °С; 3. После инкубации аккуратно отбирают около 1 мл суспензии над спермой, чтобы не повредить нижний слой и интерфазу и центрифугируют при 600 g в течение 10 мин до образования осадка из сперматозоидов; 4. Отбирают осадок и затем ресуспендируют в малом объёме подходящей среды для приготовления сперматозоидов или среды для оплодотворения, чтобы использовать при внутриматочной инсеминации, ЭКО или ИКСИ; 5. Подсчитывают сперматозоиды и вычисляют концентрацию. Хранят в инкубаторе с 6% CO2 при 37°С. Методика выделения предварительно отмытых сперматозоидов методом всплытия заключается в следующем: 1. В коническую пробирку отбирают аликвоту разжиженного эякулята и добавляют примерно такой же объём буфера для гамет. Центрифугируют при 300 g в течение 20 мин; 2. Удаляют супернатант, а осадок ресуспендируют в буфере для гамет. Центрифугируют при 300 g в течение 10 мин; 3. Удаляют супернатант, а на осадок наслаивают среду для сперматозоидов и инкубируют в атмосфере CO2 в течение 1 ч при 37 °С; 4. Отбирают супернатант со «всплывшими» сперматозоидами и перенесите в чистую пробирку, подсчитывают концентрацию спермиев. Lachaud С. и соавт. (2004) в своём исследовании для выделения сперматозоидов из спермы методом «swim-up» аликвоту разжиженного эякулята центрифугировали сначало с PBS при 220 g в течение 10 мин, а после удаления семенной плазмы, полученный осадок ресуспендировали в 1 мл среды Menezo B2 (BioMerieux, France) и инкубировали (вертикально) в течение 1 часа при температуре 37°С в атмосфере 5% СО2. В конце инкубации отбирали подвижную фракцию сперматозоидов. 4. Сравнение метода «swim-up» и метода центрифугирования эякулята в градиенте плотности По сути, метод «swim-up» отделяет сперматозоиды от остального состава эякулята исключительно на основании их подвижности. Хотя этот метод и увеличивает процент выделения подвижных сперматозоидов при обработке эякулята, однако малоподвижные сперматозоиды тоже могут попадать в среду вместе с активно подвижными, как и сперматозоиды с морфологическими дефектами и поврежденной ДНК, т.е. метод «swim-up» не отделяет ни морфологически деформированные, ни сперматозоиды с нарушенным хроматином. К сожалению, в процессе «swim-up» не удаляются бактерии и вирусы, тогда как присутствие продуцируемых бактериями эндотоксинов или реакционноактивных соединений кислорода из клеток, мёртвых или погибающих сперматозоидов, оказывает губительное действие на функциональную полноценность хроматина, на оплодотворяющую способность и выживаемость всех сперматозоидов. Напротив, центрифугирование в градиенте плотности фракционирует клеточные популяции в соответствии с их плотностью и подвижностью. В процессе центрифугирования сперматозоиды перемещаются к той позиции в градиенте, которая отвечает их собственной плотности, т.е. к их изопикнической точке. Так, сперматозоиды с нарушенным хроматином обладают меньшей плотностью и будут задерживаться в верхнем слое или на границе раздела сред градиента. Подобным образом изопикническая точка для сперматозоидов с морфологическими дефектами головки будет находиться на другом уровне из-за их отличающейся плотности, на котором они и будут концентрироваться. Таким образом, сперматозоиды с неповрежденной ДНК находятся в прямой зависимости от доли сперматозоидов с интактной ДНК. Кроме того, в процессе градиентного центрифугирования могут быть отделены другие клетки, присутствующие в эякуляте, например, лейкоциты и эпителиальные клетки, так же как мёртвые и погибающие сперматозоиды, которые служат источником реакционноактивных форм кислорода и могут вызывать оксидативный стресс. Одновременное удаление сперматозоидов с повреждённым хроматином и источников реакционногенных видов кислорода должно смягчить воздействие их высокой концентрации на образцы спермы в процессе её обработки. Некоторые авторы считают, что применение перколла позволяет более полно выделить из нативного эякулята прогрессивно подвижные сперматозоиды. В то же время Lachaud С. (2004) и другие авторы считают, что популяция сперматозоидов, полученная при использовании метода «swim-up», характеризуется лучшими кинематическими параметрами, а также меньшим числом нежизнеспособных и апоптотических сперматозоидов по сравнению с популяцией клеток, выделенных методами простого отмывания от семенной плазмы и непрерывного центрифугирования в градиенте плотности перколла. Относительно того, какой из методов выделения фракции подвижных клеток в большей степени повышает долю морфологически нормальных сперматозоидов, нет единого мнения. Имеются указания как на преимущества использования перколла, так и «swim-up», а также равную эффективность этих методов. В отличие от «swim-up» в процессе градиентного центрифугирования удаляются аномальные сперматозоиды, посторонние клетки и бактерии. Сперматозоиды с дефектами морфологии способны осуществлять оплодотворение, однако дальнейшее развитие таких эмбрионов и развитие беременности могут быть нарушены: имеются сведения о взаимосвязи морфологии сперматозоидов и процента оплодотворения. Prakash P., и соавт. (1998) считают, что использование метода градиентного центрифугирования для приготовления образцов спермы помогает улучшить результативность программ ВРТ за счет повышения оплодотворяемости ооцитов. Сперматозоиды с дефектами хроматина конкурируют с нормальными спермиями в процессе оплодотворения, поэтому во избежание получения эмбрионов низкого качества очень важно не допустить их попадание в суспензию, предназначенную для ЭКО. По данным Воробьевой О.А. и соавт. (2005) сравнительный анализ этих двух основных методов выделения прогрессивно подвижной фракции сперматозоидов показал, что метод «swim-up» более эффективен в селекции клеток с нормальным хроматином, чем градиент плотности. По данным Gandini L. (2004) и Spano M. (1999) после обработки в градиенте «PureSperm» в некоторых случаях степень повреждения ДНК – индекс фрагментации (ИФ) – повышался. Средний ИФ в эякуляте составлял 12%, после применения «swim-up» – 5,5%. Воробьёва О.А. (2005) и Леонтьева О.А. (1999) считают, что наиболее эффективным для выделения из нативного эякулята фракции прогрессивно подвижных форм сперматозоидов и при селекции клеток с нормальной структурой хроматина, является комбинированный метод, суть которого заключается в последовательном применении центрифугирования в изотоническом 90% перколле и дальнейшего всплытия сперматозоидов из полученного осадка. Эта модификация позволяет сочетать преимущества обеих методик. В частности, было показано, что при этом эффективно повышается доля сперматозоидов с нормальной структурой хроматина. Применение комбинированного метода выделения прогрессивно подвижной фракции позволяет получить популяцию сперматозоидов со значительно лучшими морфологическими характеристиками по сравнению с нативным эякулятом как при нормо-, так и при патоспермии. Немаловажным при выделении сперматозоидов из нативного эякулята для селекции клеток с целью дальнейшего их использования в программах ВРТ является контроль контаминации. Эякулят кроме основных компонентов – семенной жидкости (спермоплазмы) и сперматозоидов, содержит так же иммунные и эпителиальные клетки, клеточный дебрис и имеет собственную микрофлору, содержит бактерии. Вирусное обсеменение тоже может иметь место. Каждый из этих компонентов оказывает значительное влияние на выживаемость и оплодотворяющую способность сперматозоидов. Поэтому иногда использование методов «swim-up» и фракционирования в градиенте плотности необходимо при обработке контаминированных вирусами эякулятов. Бактерии в приготовленных образцах спермы могут контаминировать среду, используемую в программах ЭКО для культивирования эмбрионов. Наличие бактерий в эякуляте при их адгезии на поверхности сперматозоидов может оказывать прямое влияние на фертильные свойства последних через угнетение их подвижности, преждевременное индуцирование акросомной реакции и изменение морфологии. Более того, бактериальная микрофлора может проявлять непрямое воздействие, продуцируя эндотоксины. Факторы патогенности и отдельные структурные компоненты бактериальной клетки могут повреждать нуклеарный хроматин в сперматозоидах, влиять на оплодотворяющую способность и вызывать апоптоз сперматозоидов. Даже, несмотря на высокий процент оплодотворения ооцитов в культурах, инфицированных некоторыми микроорганизмами, эмбрионы неспособны в них развиваться до стадии бластоцисты. Поэтому очень важным с точки зрения защиты гамет от повреждения и предупреждения аллергических реакций у пациентов и медицинского персонала является контроль бактериальной контаминации в обработанных образцах спермы без использования антибиотиков, так как некоторые из них могут быть токсичны для спермы. Сочетание пенициллина и стрептомицина может быть использовано в средах для сперматозоидов, но пенициллин G разрушается в культуральной среде на 50% в течение 24 ч при 37° С. Таким образом, предпочтительнее использовать такую технологию приготовления спермы для удаления бактериальной микрофлоры, которая позволяет избежать добавление антибиотиков в среду для отмывки сперматозоидов. Способность градиента PureSperm удалять вирусы, например, вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) или вирус гепатита С, имеет важное значение для предложения ВРТ супружеским парам, в которых муж инфицирован. Применение градиента PureSperm в сочетании с методом «swim-up» при выделении сперматозоидов для ВРТ способно снижать вирусную контаминацию ниже уровня детекции и является безопасной альтернативой для зачатия ребенка у супружеских пар, в которых муж серопозитивен по ВИЧ. В то же время отделение всех вирусов от популяции сперматозоидов может быть невозможным. Так, например, с помощью полимеразной цепной реакции удалось идентифицировать ДНК вируса папилломы человека в сперматозоидах после обработки в градиенте перколла, т.е. сперматозоиды могут служить в качестве векторов для определенных вирусов. Однако некоторые авторы считают, что вирус папилломы человека может удаляться градиентом плотности PureSperm. Таким образом, анализируя данные разных исследований, проведённых как в России, так и за рубежом, можно заключить, что до настоящего времени не сложилось единого мнения, какой метод лучше использовать для выделения сперматозоидов из нативного эякулята. Выбор метода зависит от того, проводится выделение половых клеток для исследовательских целей или для клинического использования, а так же от характеристик эякулята и правил, предусмотренных в конкретной лаборатории. |
1 2
Похожие:
 |
«Руководство воз по лабораторному исследованию и обработке эякулята... Спермограмма (при патоспермии необходимо предоставить не менее двух спермограмм ) |
 |
«Руководство воз по лабораторному исследованию и обработке эякулята... Спермограмма (при патоспермии необходимо предоставить не менее двух спермограмм ) |
|
Сегментация томографических изображений грудной клетки человека для... Сегментация томографических изображений грудной клетки человека для автоматизированного выделения и визуализации тромбов |
|
Инструкция по применению питательного агара для выделения листерий палкам ... |
|
Инструкция по применению питательного агара для выделения листерий пал ... |
|
Анкета оценки нервно-психической устойчивости «прогноз» Лвма им. С. М. Кирова и предназначена для первоначального выделения лиц с признаками нервно-психической неустойчивости. Она позволяет... |
|
Инструкция по применению набора реагентов для бактериологических исследований Набор реагентов для бактериологических исследований «Питательный агар для культивирования и выделения возбудителя бруцеллёза сухой... |
|
Методические рекомендации приемы психологической саморегуляции Часть... Представлены способы саморегуляции эмоциональных состояний; упражнения, направленные на концентрацию внимания, работу с тонусом мышц... |
|
Фармакология (наука о лекарственных средствах и их применении) и... Лекарственные средства (медикаменты, фармакологические препараты) это растительные, животные или химические вещества (или препараты),... |
|
Методы диагностики одержания человека Признаки одержания и состояния ж. М. По глазным проявлениям. Некоторые внеглазные признаки этих состояний 9 |
|
Тема современные методы системных исследований Основные направления социологических исследований. Методы, используемые в рамках социологических исследований. Методологическая стратегия... |
|
Курс-конспект лекций и контрольные задания Рига 2006. Методическое... Современная психодиагностика определяется как психологическая дисциплина, разрабатывающая методы выявления и изучения индивидуально... |
|
Лекция № «Роль семьи в жизни человека. Планирование семьи. Укрепление... Систематизировать и закрепить знания студентов по данной теме, овладеть умениями и навыками высчитывания плодных дней, регистрации... |
|
1 Понятие бжд, опасности. Классификация опасности бжд научная дисциплина,... Опасность – явления, процессы, объекты, способные в определенных условиях наносить ущерб здоровью человека |
|
Отраслевой дорожный методический документ методы Методы укрепления откосов земляного полотна автомобильных дорог засевом трав в различных климатических зонах |
|
Методические рекомендации по изучению дисциплины «Методы исследований... Целью освоения дисциплины «Методы исследования в социальной работе» является формирование целостной системы знаний об основных общенаучных... |