Учебно-методический комплекс дисциплины «Морская микробиология»
|
Скачать 2.66 Mb.
|
|
Дихотомический ключ для идентификации листерий. При таком подходе используется ограниченное количество пробирочных (чашечных) тестов. Одни и те же тесты могут использоваться неоднократно на разных ветвях информационного дерева. Очень важным при таком подходе оказывается ранжирование тестов по их значимости и выбор «ключевых» тестов. Это связано со следующими обстоятельствами: Изучаемый признак должен встречаться (или отсутствовать) у всех штаммов данного вида, т.е. в 100% случаев. В противном случае атипичные по этому признаку штаммы никогда не будут правильно идентифицированы. Воспроизводимость всех тестов должна приближаться к 100%. Традиционная клиническая микробиология, базировавшаяся на указанных выше принципах, была не только трудоемкой и материалоемкой, но и требовала высокой квалификации персонала . Вторая система идентификации, построенная на принципах нумерической (числовой) таксономии получила широкое распространение с начала 70-х годов. Основные ее положения были разработаны еще в 50-е годы. Прорыв в развитии вычислительной техники и особенно появление в конце 70-х персональных компьютеров, а также разработка коммерческих тест-систем позволили реализовать эти положения на уровне практических лабораторий. Нумерическая таксономия базируется на следующих принципах: 1. Необходимо изучить максимально возможное количество признаков (в современных коммерческих тест-системах их количество колеблется от 12 до 25-30); 2. Все изучаемые признаки имеют равный вес; 3. Результат идентификации выглядит как коэффициент соответствия свойств выделенной культуры свойствам эталонных штаммов. Использование указанных принципов и кластерного анализа при изучении коллекций культур позволяет проследить идущие эволюционные процессы и появление новых таксонов. Так Staphylococcus lugdunensis был открыт благодаря использованию тест-системы API (bioMerieux, Франция). Существует два основных типа таких систем. Наиболее широкое распространение получили индивидуальные системы, расчитанные на идентификацию одной культуры. К ним относятся отечественные тест-ситемы ПБДЭ, ПБДС (НПО «Диагностические системы», г. Н.Новгород), семейство систем API (BioMerieux, Франция) и многие другие. Второй тип систем идентификации основан на использовании многорядных планшетов, в которых каждый ряд лунок позволяет идентифицировать одну культуру. Как правило, используются стандартные 96-луночные полистироловые планшеты аналогичные тем, что применяются в иммуноферментном анализе. К системам этого типа относятся наиболее широко распространенные в нашей стране тест-системы фирмы Lachema (Чехия), а также идентификационные наборы ММТ Е (НПО «Аллерген», г. Ставрополь). Для небольших и средних лабораторий более удобны индивидуальные тест-системы. Попытки использовать панели на 8-12 культур в несколько приемов могут стать причиной дополнительных ошибок, так как при термостатировании происходят изменения в неиспользуемых лунках. Идентификация выделенной культуры состоит из следующих этапов:
Для приготовления суспензии, как правило, используется стерильный изотонический раствор, однако в некоторых случаях необходимо использовать специальные буферы или инокуляционные среды, входящие в состав набора. Концентрация микроорганизмов в суспензии определяется по оптическому стандарту мутности. В международной практике используется шкала McFarland, в нашей стране – оптические стандарты мутности, производства Российского Государственного института медицинских и биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича. Неправильное приготовление суспензии (слишком высокая или наоборот низкая концентрация микроорганизмов, использование старой культуры и т.д.) может явиться причиной неправильного срабатывания системы. В зависимости от конструктивных особенностей диагностического набора для инокуляции могут быть использованы градуированные пипетки, микродозаторы, пастеровские пипетки. В некоторых тест-системах инокуляция осуществляется методом погружения (“Crystal”) или при помощи специального инокулирующего стержня (“Enterotube II”). Инкубация тест-систем проводится в обычных термостатах или в специальных термостатируемых устройствах, входящих в комплект некоторых автоматизированных систем идентификации (“Vitek”, bioMerieux, Франция). При идентификации анаэробных микроорганизмов, обычно, требуется создание безкислородной атмосферы, однако некоторые системы, основанные на выявлении предсинтезированных ферментов, инкубируются в аэробных условиях. Температура и время инкубации, указанные в инструкции фирмы-изготовителя должны выдерживаться максимально точно. Несоблюдение этих параметров является одной из наиболее частых причин неправильной идентификации культуры. Таблица Системы биохимической идентификации бактерий
Учет результатов осуществляют либо визуально, либо при помощи специальных считывающих устройств – «ридеров». Их использование позволяет избежать субъективизма при оценке реакции и в конечном счете повышает достоверность идентификации. В некоторых случаях (реакция Фогеса-Проскауэра, тесты на нитратредуктазу, фосфатазу, индол и др.) перед учетом результата теста в лунку необходимо добавить специальные проявляющие реактивы. При этом необходимо использовать только реактивы, входящие в состав диагностического набора. После учета всех тестов производится кодирование результатов. В простейшем случае каждый положительный признак обозначают знаком «+», а отрицательный – знаком «-». Такое кодирование без использования компьютера делает заключительный этап идентификации весьма продолжительным и трудоемким. В современных системах идентификации для определения «профиля» (кода) культуры используемые тесты разбивают на триады (таблица ). Положительный результат каждого из тестов, входящих в триаду оценивается как 2n, где n = 2, 1 или 0, т.е. положительный результат первого теста в триаде кодируется цифрой «4» (22), второго – цифрой «2» (21) и третьего – цифрой «1» (20). Отрицательный результат теста всегда обозначается «0». При сложении результатов тестов в триаде получаем значение от «0» (все тесты в триаде отрицательны) до «7» (все тесты в триаде положительны). Каждая триада дает одну цифру «профиля». Полученный «профиль» может быть использован либо для последующей компьютерной обработки, либо для ручной идентификации с помощью кодовой книги. Таблица Профиль культуры
637 = Staphylococcus epidermidis Примечание GLY – глицерин, SUC – сахароза, TRE – трегалоза, MAN – маннит, URE – уреаза, VPT – ацетоин, PHS – фосфатаза, NIT – нитраты, Cat – каталаза. Как правило, фирмы выпускающие системы для биохимической идентификации микроорганизмов разрабатывают и специальное программное обеспечение для компьютерной обработки результатов. Основу таких программ составляет база данных содержащая частотную матрицу признаков для идентифицируемых микроорганизмов. «Фирменные» программы могут использоваться только с той тест-системой, для которой они разработаны. В то же время существуют различные программы-оболочки, позволяющие пользователю самостоятельно вносить частотные характеристики признаков. Примером может служить бесплатно распространяемая программа IdBact версия 1.1, которая доступна в Интернете на сервере Каролинского университета (Швеция) по адресу http://www.ki.se/labmed/clim/get_copy.htm В настоящее время рядом фирм-производителей широко рекламируются системы ускоренной идентификации. Они позволяют получить ответ после 4-6 часов инкубации. Необходимо отметить, что учет этих тестов в более поздние сроки, как правило, приводит к получению неправильных результатов. Использование рапид-систем, по нашему мнению, оправдано при работе в режиме «чрезвычайной ситуации», когда лаборатория работает в круглосуточном режиме. Идентификация выделенной чистой культуры микроорганизмов предполагает определение ее видовой принадлежности. Однако в некоторых случаях в практических лабораториях оказывается вполне достаточным определение рода микроорганизмов или их принадлежности к определенной группе. В то же время, иногда исследование не заканчивается идентификацией. Так для решения эпидемиологических вопросов необходимо проведение внутривидового типирования. В настоящее время для этого обычно используют: серотипирование, фаготипирование, хемотипирование. Для доказательства этиологической роли выделенного микроорганизма в отдельных случаях также требуется постановка дополнительных тестов. Например, в случае обнаружения Corynebacterium diphtheriae, необходимо дополнительно определить токсигенность выделенной культуры. Лабораторная работа №3 Определение скорости микробных процессов Одной из основных задач экологической микробиологии является изучение функциональной активности микробного сообщества, определение скорости микробных процессов круговорота углерода, азота, серы и других биогенных элементов. Приведены различные методы определения скорости микробных процессов. Определение скорости фотосинтеза Кислородный метод Винберга В склянки объемом 50-200 мл набирают воду доверху и плотно закрывают притертой пробкой. В контрольных склянках сразу определяют содержание растворенного кислорода. Опытные склянки устанавливают на горизонтах воды, откуда были отобраны пробы, привязав к тросу, инкубируют 1-10 суток. После инкубации в опытных склянках также определяют содержание кислорода. По выделению свободного кислорода можно определить количество образовавшегося органического вещества. Определяют скорость фотосинтеза согласно соотношениям, представленным табл. Таблица Соотношение между величинами О2 и СО2 в процессе фотосинтеза и деструкции Исходные О2 СО2 мг мл мг мл С, мг 1 мг О2 - 0,6997 1, 375** 0,6997** 0,3750** 1 мл О2 1,4292 - 1,9652** 1,0000* 0,5359** 1 мл СО2 0,7273* 0,5089 - 0,5089 0,2727 1 мл СО21,4292* 1,0000* 1,9652 - 0,5359 1 мг С 2,6667* 1,8660* 3,6667 1,8660 - Примечание. Значения даны для АК (ассимиляционный коэффициент) и ДК (дыхательный коэффициент), равных 1. Если ДК и АК не равны 1 (в природных условиях наиболее вероятные значения АК=1,25 и ДК=0,8), то величину со значком* следует умножить на АК или разделить на ДК, а величину со значком** — разделить на АК или умножить на ДК. Расчет первичной продукции можно производить также расчетным методом с использованием следующих формул. 1. Валовая продукция Pg, О2мг/л·ч: Pg = (VC -VT)/t 2. Чистая продукция РN, О2мг/л·ч: PN = (VC -VH T)/t 3. Деструкция D, О2 мг/л·ч: D = (VC -VT)/t, где VH T - начальное содержание О2 в склянке перед экспонированием, мг/л; VC - содержание О2 в светлой склянке после экспонирования, мг/л; VT - содержание О2 в темной склянке после экспонирования, мг/л; t - время экспонирования склянок, ч. Путем пересчета с использованием табл. 9 величины продукции и деструкции можно выразить в единицах: мг/(м3 · сут), мг/(м3 · ч) в расчете на кислород, С орг и т.д. Потребление кислорода на деструктивные процессы рассчитывается по формуле: Qд = (Qисх – Qкон) · 24 / t, где Qд - величина деструкции Сорг, мг О2/ (л·сут); Qисх - содержание кислорода в исходной воде, мг/л; Qкон - содержание кислорода в конце инкубации, мг/л; t - время инкубации, ч. Для выражения величины деструкции в пересчёте на органическое вещество или на углерод Qд умножают на дыхательный коэффициент, равный 0,8, пересчёт делают, используя табл. . |
Похожие:
 |
Учебно-методический комплекс дисциплины «Микробиология» Учебно-методический комплекс составлен в соответствии с требованиями государственного образовательного стандарта высшего профессионального... |
 |
Учебно-методический комплекс дисциплины «Промышленная микробиология» Учебно-методический комплекс составлен в соответствии с требованиями государственного образовательного стандарта высшего профессионального... |
|
Учебно-методический комплекс дисциплины «Торговое оборудование» Учебно-методический комплекс дисциплины составлен в соответствии с требованиями государственного образовательного стандарта высшего... |
|
Учебно-методический комплекс дисциплины «организационное поведение» Учебно-методический комплекс дисциплины составлен в соответствии с требованиями государственного образовательного стандарта высшего... |
|
Учебно-методический комплекс дисциплины «Русский язык и культура речи» Учебно-методический комплекс дисциплины составлен в соответствии с требованиями государственного образовательного стандарта высшего... |
|
Учебно-методический комплекс дисциплины «Системное программное обеспечение» Учебно-методический комплекс дисциплины составлен на основании требований государственного образовательного стандарта высшего профессионального... |
|
Учебно-методический комплекс дисциплины Учебно-методический комплекс дисциплины составлен на основании государственного образовательного стандарта высшего профессионального... |
|
Учебно-методический комплекс дисциплины обсужден на заседании кафедры... Учебно-методический комплекс дисциплины составлен на основании требований государственного образовательного стандарта высшего профессионального... |
|
Учебно-методический комплекс дисциплины Учебно-методический комплекс дисциплины составлен на основании государственного образовательного стандарта высшего профессионального... |
|
Учебно-методический комплекс дисциплины архитектура ЭВМ 090104. 65... Учебно-методический комплекс дисциплины составлен на основании требований государственного образовательного стандарта высшего профессионального... |
|
Учебно-методический комплекс дисциплины «римское право» Учебно-методический комплекс дисциплины составлен в соответствии с требованиями государственного образовательного стандарта высшего... |
|
Учебно-методический комплекс дисциплины «Таможенное право» Учебно-методический комплекс дисциплины составлен в соответствии с требованиями государственного образовательного стандарта высшего... |
|
Учебно-методический комплекс дисциплины «коммерческое право» Учебно-методический комплекс дисциплины составлен в соответствии с требованиями государственного образовательного стандарта высшего... |
|
Учебно-методический комплекс дисциплины «защита прав потребителей» Учебно-методический комплекс дисциплины составлен в соответствии с требованиями государственного образовательного стандарта высшего... |
|
Учебно-методический комплекс дисциплины «право интеллектуальной собственности» Учебно-методический комплекс дисциплины составлен в соответствии с требованиями государственного образовательного стандарта высшего... |
|
Учебно-методический комплекс дисциплины «Технология формирования имиджа» Учебно-методический комплекс дисциплины составлен на основании требований государственного образовательного стандарта высшего профессионального... |