Биологические и микробиологические факторы лабораторная диагностика сапа методические указания
|
Скачать 347.38 Kb.
|
1 2
| Утверждаю Главный государственный санитарный врач Российской Федерации Г.Г.ОНИЩЕНКО 14 января 2011 года 4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА САПА МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУ 4.2.2831-11 1. Методические указания разработаны Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека; ФГУЗ "Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт" Роспотребнадзора. 2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. 3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 14 января 2011 г. 4. Введены впервые. 1. Область применения 1.1. Методические указания предназначены для специалистов как в системе органов, осуществляющих государственный санитарно-эпидемиологический надзор, так и в системе лечебно-профилактических организаций независимо от их организационно-правовой формы и формы собственности. 1.2. В методических указаниях определены порядок забора, транспортирования и выполнения лабораторных исследований биологического материала от больных и умерших людей, животных с подозрением на сап, материала из объектов окружающей среды, подозрительного на контаминацию возбудителем данного заболевания. 2. Нормативные ссылки 2.1. Санитарно-эпидемиологические правила СП 1.3.1285-03 "Безопасность работы с микроорганизмами I - II групп патогенности (опасности)". М., 2003. 2.2. Санитарные правила СП 1.2.036-95 "Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I - IV групп патогенности". М., 1996. 2.3. МУ 1.3.1794-03 "Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами I - II групп патогенности". М., 2004. 2.4. МУК 4.2.1890-04 "Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам". М., 2004. 2.5. МУ 3.5.5.1034-01 "Обеззараживание биологического материала и объектов внешней среды, зараженных бактериями I - IV групп патогенности, при исследованиях методом ПЦР". М., 2001. 2.6. Методические рекомендации "Лабораторная диагностика, лечение и профилактика сапа". Волгоград, 1995. 2.7. Практическое руководство "Специфическая индикация патогенных биологических агентов". М., 2006. 2.8. Практическое руководство "Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней". М., "Медицина", "Шико", 2009. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ Аг антиген А-ПХ авидин-пероксидаза хрена Ат антитело АСК аминосалициловая кислота Г + Ц гуаниновые и цитидиновые нуклеотиды ЕД единица действия ЖМАС жидкая минимальная среда с антибиотиками ИПК иммунопероксидазный конъюгат ИФА иммуноферментный анализ КББ карбонатно-бикарбонатный буфер МПГА (МПГБ) мясо-пептонный агар (бульон) с глицерином МПК минимальная подавляющая концентрация МФА метод флуоресцирующих антител НКС нормальная кроличья сыворотка НЛС нормальная лошадиная сыворотка НЦМ (НЦФ) нитроцеллюлозная мембрана (фильтр) ОП оптическая плотность ППН показатель повреждения нейтрофилов ПЦР полимеразная цепная реакция РА реакция агглютинации РИА радиоиммунный анализ РКоА реакция коагглютинации РНГА реакция непрямой гемагглютинации РСК реакция связывания комплемента РТГА реакция торможения непрямой гемагглютинации ТИФА (М) твердофазный иммуноферментный анализ (метод) ТМБ тетраметилбензидин ТСА (ТСБ) триптиказосоевый агар (бульон) ФБР + Т фосфатный буферный раствор + Твин-20 ЦФБР цитратно-фосфатный буферный раствор ЭД эритроцитарный диагностикум 3. Общие сведения Сап - зоонозная инфекция, протекающая у человека в острой септической и хронической формах со специфическими поражениями кожи, слизистых оболочек, мышц, суставов и внутренних органов. Основным резервуаром инфекции в естественных условиях являются преимущественно однокопытные - лошади, ослы, мулы, а также верблюды и дикие хищники семейства кошачьих. В настоящее время сап у лошадей отмечается в Монголии, Турции, Иране, Ираке, Китае, Индии, Индонезии и на Филиппинах. В России существует опасность заноса инфекции из-за рубежа. Источником инфекции для людей служат животные, обычно лошади. Заражение происходит через выделения больного животного: носовой секрет и отделяемое кожных язв, реже - содержимое кишечника, моча, молоко. Восприимчивость людей к сапу оценивается неоднозначно. С одной стороны, в начале прошлого века количественное соотношение больных лошадей и имевших к ним отношение людей измерялось как 200 - 400 к 1, на основании чего делался вывод о высокой видовой устойчивости человека к этой инфекции. С другой стороны, соотношение хронических и острых форм заболевания у лошадей составляет 9:1, а среди людей - 1:1, что предполагает более высокую чувствительность людей к сапу. Основной путь заражения в естественных условиях - контактный (80% случаев): через кожу верхних и нижних конечностей, лица и шеи, значительно реже - через слизистые оболочки верхних дыхательных путей и конъюнктиву глаз. Фактически сап является профессиональной болезнью. В прошлом сапом заболевали конюхи, ветеринары, работники конских боен. Описаны случаи внутрилабораторных заражений ветеринарных и медицинских работников, известны случаи заболевания после повреждения кожи при вскрытии трупов больных сапом. Считается, что аэрозоли культур высоко инфекциозны для человека. Большинство описанных случаев заражения сапом в лабораторных условиях связано с проникновением возбудителя через дыхательные пути. При анализе профессиональных случаев заболеваний микробиологов, работающих с особо опасными инфекциями, B. mallei ставят в один ряд с возбудителями чумы и туляремии. В последнее время описаны 2 случая внутрилабораторного заражения (по одному в США и в России), в одном случае заболевание закончилось летальным исходом, в другом - потребовало длительного комплексного лечения химиопрепаратами. Передача от человека к человеку спорна, хотя в литературных источниках начала XX века описаны отдельные случаи таких заражений - при уходе за больными людьми и животными без специальных мер предосторожности. Возбудитель сапа Burkholderia mallei относится к патогенным представителям рода Burkholderia (выделен в автономную таксономическую единицу в 1992 г. из представителей 2-й группы pРНК-ДНК гомологии обширного таксономически аморфного рода Pseudomonas), вызывает тяжелое инфекционное заболевание у человека и довольно широкого круга животных. В экспериментальных условиях наиболее чувствительными к сапу животными являются кошки, золотистые хомячки и морские свинки. Кролики мало восприимчивы к сапу. Белые мыши и крысы - высокорезистентны. Возбудитель сапа - неподвижная (атрих) тонкая полиморфная палочка, прямая или несколько изогнутая, с закругленными концами, размером 0,4 x 3 - 5 мкм. Наряду с типичными клетками могут встречаться очень короткие коккобациллярные (в молодых культурах), булавовидные и ветвящиеся формы (в старых культурах). Спор и капсул возбудитель сапа не образует. B. mallei относительно устойчива во внешней среде: в подсохших выделениях больных микроб сохраняет жизнеспособность до трех месяцев, в воде и различных гниющих субстратах - до месяца. При нагревании взвеси чистой культуры возбудитель сапа погибает при 60 °C через 2 ч и более, при кипячении - в течение нескольких минут. Хлорная известь (2% раствор) вызывает гибель B. mallei через несколько мин., 1% едкий натр - через 1 ч. Возбудитель сапа обладает устойчивостью к пенициллинам, полимиксинам, ванкомицину, хиноксидину и диоксидину, что используется в качестве дифференциального теста. 4. Материал для исследования, отбор и транспортирование проб Вся работа с исследуемым материалом, подозрительным на зараженность возбудителем мелиоидоза, проводится в соответствии с требованиями по безопасности работы с микроорганизмами I - II групп патогенности (санитарными правилами СП 1.3.1285-03 "Безопасность работы с микроорганизмами I - II групп патогенности (опасности)" и СП 1.2.036-95 "Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I - IV групп патогенности", а также методическими указаниями МУ 1.3.2569-09 "Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I - IV групп патогенности"). Идентификация возбудителя сапа предусматривает выделение возбудителя (или антигенов) из объектов исследования и определения специфических антител в крови людей и животных. Схема и последовательность бактериологических и иммунологических этапов представлены ниже (рис. 1). ┌───────────────┐ ┌──────────────┐ │ Исследуемый │ │Кровь больного│ │ материал │ │ (серология) │ │(бактериология)│ └───────────┬┬┬┘ └─┬┬┬───────┬──┬┘ │││ ┌───┐ │││ │ │ │││ ┌──┐ │ПЦР├─────────────┘││ │ │ ││└───────┤РА│ └───┘ ││ │ │ ││ └──┘ ┌───┐ ││ │ │ ││ ┌────┐ │МФА├──────────────┘│ │ │ │└──────┤РСК │ └───┘ │ │ │ │ └────┘ ┌─────────────────┐ │ │ │ │ ┌────┐ │ Бактериоскопия │ │ │ │ └───────┤ТИФА│ │Грамотрицательные├─┘ │ │ └────┘ │ палочки │ │ └───────────────────────┐ └─────────────────┘ ┌──────┴───────┐ │ ┌───────┴──────┐ ┌───┴──┐ ┌─────────┴────────┐ │ МПГА (ТСГА) │ │ МПГА │ │ Биопроба │ │с ингибиторами│ │(ТСГА)│ │Золотистые хомячки│ └──────────────┘ └──────┘ │ (21 день) │ └──────────────────┘ Рис. 1. Этапы идентификации Burkholderia mallei Примечание: Постановка, оценка реакций и расшифровка сокращений - по тексту. Исследование на сап начинается одновременно бактериологическим, биологическим и серологическим методами. С момента поступления материала проводят бактериоскопию мазков в световом и люминесцентном микроскопах, бактериологическое исследование, направленное на выделение культуры сапного микроба, биологическое исследование, как дополнительное для выделения "чистой" культуры, и серологическое исследование нативного материала для выявления видоспецифического антигена или специфических антител. Материалом для исследования от людей и животных с подозрением на сап могут быть выделения из носа, отделяемое язв, пунктаты лимфоузлов, мокрота, испражнения. Материал по возможности должен быть исследован до начала лечения химиотерапевтическими препаратами. При вскрытии трупов животных берут для анализа кусочки органов (селезенка, печень, легкое), лимфатических узлов, кровь, костный мозг. При длительном транспортировании в стационарные бактериологические лаборатории рекомендуется пользоваться средами с ингибиторами (п. 5.1). Заключение бактериолога дается на основании бактериоскопического, бактериологического и серологического исследований. 5. Методы исследования материала 5.1. Бактериологический метод Для выделения возбудителя сапа используют мясопептонный агар и бульон pH 6,8 - 7,0 с 4% глицерина (МПГА, МПГБ). Можно использовать агар на основе гидролизата казеина, а также питательный агар и триптиказосоевый агар (Difco, США). При использовании "загрязненного" материала (что подтверждается микроскопией) используют среду с ингибиторами: пептон 6,0 г дрожжевой экстракт 3,0 г NaCl 5,0 г ванкомицин 0,01 г глицерин 40,0 г полимиксин B 0,01 г кристаллвиолет 0,002 г агар 12,0 г мясная вода pH 6,8 до 1 л Исследуемый материал высевают на три чашки агаровой среды и 3 пробирки бульона с последующим высевом на плотную среду, инкубируют в течение 48 - 72 ч при температуре 37 °C. Учет производят ежедневно. Возбудитель сапа вырастает в виде слабовыпуклых колоний с ровным краем, серого цвета (RS-вариант). В отличие от B. pseudomallei для B. mallei морфологическая диссоциация не характерна, хотя отдельные колонии бывают сморщенные (R-) или слизистые (M-). 5.2. Биологический метод Биологический метод эффективен для диагностики острого сапа, выделить же возбудитель этим методом при хроническом течении сапа чаще всего не удается. В данном случае более эффективными могут быть иммунологические исследования и выделение L-форм возбудителя сапа. Для постановки биопробы при диагностике сапа используют золотистых хомячков или морских свинок. Кусочки органов животных или людей измельчают в физиологическом растворе. Экстракт в объеме 0,5 мл вводят подкожно в область бедра биопробным животным. При исследовании "чистого" материала (подозрительные колонии на МПГА) животных можно заражать внутрибрюшинно. Срок наблюдения за биопробными животными - до 21 сут., в типичных случаях падеж и выделение "чистой" культуры происходят в первые 10 сут. после инфицирования. Для интраперитонеального заражения желательно брать самцов, у которых развивается феномен Штрауса. Этот феномен может быть ориентиром для вскрытия животных. Однако следует иметь в виду, что наблюдаемый гнойный периорхит не специфичен и может быть вызван другими микроорганизмами. Павших или забитых больных животных вскрывают и исследуют бактериологически для выделения "чистой" культуры. С этой целью из их органов делают высевы на обычные питательные среды и параллельно на среду с ингибиторами. 5.3. Иммунологические методы исследования Специфическая индикация сапа Метод флуоресцирующих антител (МФА). МФА - широко используемый метод экспресс-обнаружения возбудителя сапа в различных объектах исследования. Он позволяет получать предварительный ответ в течение 1 - 2 ч от момента начала исследования, а также идентифицировать возбудитель сапа на этапах ускоренного и классического лабораторного анализа биологически обогащенного материала. Для выявления возбудителя сапа с помощью МФА используют иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие сапные моноклональные сухие. Препарат в рабочем разведении взаимодействует только с бактериями сапа и не окрашивает клетки близкородственного возбудителя мелиоидоза. При работе с чистыми 4 культурами типичных штаммов возбудителя сапа он позволяет выявлять 5 x 10 4 5 м.к./мл, в бактериальных смесях - 5 x 10 - 1 x 10 м.к./мл, в объектах 4 5 внешней среды - 5 x 10 - 5 x 10 м.к./мл в зависимости от характера исследуемого объекта, его обсемененности посторонней микрофлорой. На этапе экспресс-анализа используют МФА с контрастированием неспецифического свечения микрообъектов. При идентификации чистых культур микроорганизмов контрастирование не требуется. Мазки из проб внешней среды и из материала от больных и умерших людей и животных (до и после концентрирования) готовят на тонких обезжиренных предметных стеклах, высушивают на воздухе и фиксируют в 96%-ном этиловом спирте в течение 30 мин. Окрашивание мазков-препаратов проводят смесью равных объемов флуоресцирующих сапных моноклональных антител и альбумина, меченного родамином, содержащей каждый из ингредиентов в рабочих разведениях, указанных на ампулах. Результаты взаимодействия поверхностно локализованных антигенов возбудителя сапа с антителами, меченными флуоресцеинизотиоцианатом, регистрируют с помощью люминесцентного микроскопа, оценивая яркость свечения и его цвет по общепринятой шкале регистрации результатов МФА, а также форму, размеры и локализацию флуоресцирующего объекта исследования. В мазках-препаратах из объектов внешней среды и смывах с поверхности питательных сред, на которых производили накопление микроорганизмов, бактерии сапа, окрашенные специфическими иммуноглобулинами, расположены хаотично, в виде изолированных прямых или изогнутых ярко светящихся палочек, изредка соединенных в цепочки, состоящие из 4 - 8 фрагментов. Вследствие характерного для возбудителя сапа полиморфизма возможно обнаружение длинных, средних, коротких палочек, кокко- или нитеподобных форм бактерий. В мазках-отпечатках из органов и тканей животных короткие толстые палочки расположены беспорядочно, иногда группами, внеклеточно, редко внутри лейкоцитов, клеток паренхиматозных органов или соединительной ткани. На этапе экспресс-анализа нативного материала обнаружение единичных (не менее 10) клеток в 25 - 30 полях зрения, обладающих специфическим свечением, является основанием для выдачи ориентировочного положительного ответа. Отрицательный результат МФА свидетельствует либо об отсутствии возбудителя сапа в исследуемом объекте, либо о том, что концентрация бактерий в данной пробе ниже улавливаемой с помощью МФА. Твердофазный иммуноферментный метод (ТИФМ). ТИФМ - один из наиболее чувствительных методов обнаружения возбудителя сапа в различных объектах исследования. В отличие от МФА он позволяет выявлять как бактерии, так и растворимые антигены возбудителя сапа. По чувствительности ТИФМ в 10 - 20 раз превосходит МФА, в 30 раз - РНГА. При использовании ТИФМ для поиска возбудителя сапа обязательным является этап предварительного обеззараживания проб 1%-ным формалином. Перспективным является дот-вариант ИФА, варианты которого применяют как 4 6 для обнаружения возбудителя сапа (1 x 10 - 1 x 10 м.к./мл), так и выявления специфических антител в исследуемых сыворотках. Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА). При поиске сапных бактерий и их антигенов объектами исследования являются все перечисленные выше образцы проб. Особенности подготовительного этапа заключаются в том, что все пробы переводят в жидкую фазу в соответствии с общепринятыми методиками. Исследуемые образцы обеззараживают нейтральным формалином, добавляя его в пробы до 4% концентрации (0,2 мл на 2 мл пробы). Затем пробы прогревают при 56 °C в течение 30 мин. В пробирки с инактивированным материалом вносят 50%-ную взвесь формалинизированных эритроцитов из расчета 0,05 мл на 1 мл пробы для истощения материала и устранения возможных неспецифических взаимодействий ингредиентов РНГА. Смесь тщательно встряхивают, выдерживают при 37 °C в течение 15 мин. и центрифугируют при 2000 - 3000 об./мин. в течение 10 мин. Надосадочную жидкость используют для постановки РНГА с диагностикумом эритроцитарным сапным и мелиоидозным иммуноглобулиновым сухим на основе поликлональных антител или диагностикумом эритроцитарным сапным и мелиоидозным моноклональным сухим на основе моноклональных иммуноглобулинов. РНГА с иммуноглобулиновым ЭД применяют на этапах экспресс- и ускоренного анализа проб и идентификации чистых культур. Учет результатов РНГА производят через 1,5 - 2,0 ч и 24 ч. Предварительный ответ о наличии искомого антигена может быть дан через 1,5 - 2,0 ч от момента постановки реакции. |
1 2
Похожие:
 |
Биологические и микробиологические факторы Порядок организации и проведения лабораторной диагностики бруцеллеза для лабораторий территориального, регионального и федерального... |
|
Методические указания му 2… Лабораторная диагностика, лечение и профилактика особо опасных микозов. Методические указания. 2009. 66 с |
 |
Методические указания для студентов по выполнению лабораторных работ... Лабораторная работа 4, 5 Исследование регистров, счетчиков и дешифраторов Лабораторная работа 6, 7 Исследование генератора псевдослучайной... |
|
Примерная программа профессионального модуля пм. 02. Проведение лабораторных... Примерная программа профессионального модуля разработана на основе Федерального государственного образовательного стандарта по специальностям... |
|
Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и... Внебольничные пневмонии: классификация, патогенез, этиология, эпидемиология, лабораторная диагностика на современном этапе. Аналитический... |
|
Методические указания по выполнению лабораторных работ Казань 201 Эксплуатация, диагностика и надежность гту: метод указания/ сост.: Б. М. Осипов, А. В. Титов, Р. Г. Сагадеев. Казань: Казан гос... |
|
Лабораторная работа 1 4 лабораторная работа 2 13 лабораторная работа... Интернете разнообразную информацию – описательную, графическую, картографическую и пр. При разработке сайтов необходимо уметь работать... |
|
Методические указания по практической работе профессионального модуля Методические указания предназначены для выполнения практической работы профессионального модуля пм. 04 Диагностика автомобилей. В... |
|
Методические указания по выполнению лабораторных работ Казань 2013 Эксплуатация, диагностика и надежность гту: метод указания/ сост.: Б. М. Осипов, А. В. Титов, Р. Г. Сагадеев. Казань: Казан гос... |
|
Лабораторная работа №7 Тема: «Арифметические операции. Битовые команды» Методические указания к выполнению лабораторных работ по мдк 01. 01 «Системное программирование» |
|
Методические указания к выполнению лабораторных работ по дисциплине радиолокационные системы Лабораторная работа №1 «Изучение принципов построения штатной радиолокационной киа» |
|
Методические указания к лабораторным работам по дисциплине «Технологии... Лабораторная работа 2 Составление календарного плана разработки портала вуза 16 |
|
Лабораторная работа №9 59 Лабораторная работа №10 72 Лабораторная... Рабочая тетрадь для выполнения лабораторных работ по мдк. 03. 01. «Техническое обслуживание и ремонт компьютерных систем и комплексов»... |
|
Методические указания для выполнения лабораторных работ и «Базы данных» Лабораторная работа №1 «Организация хранения данных в субд ms access» |
|
Методические указания для студентов к практическому занятию на тему... Тема: ««Дифференциальная диагностика нарушений ритма и проводимости. Экг интерпретация»» |
|
Методические указания для студентов к практическому занятию на тему... Тема: ««Дифференциальная диагностика нарушений ритма и проводимости. Экг интерпретация»» |