Исследование генетического разнообразия и процессов видообразования эндемичного семейства рыб озера байкал голомян ок (comephoridae)
|
Скачать 327.42 Kb.
|
|
На правах рукописи ТЕТЕРИНА ВЕРОНИКА ИГОРЕВНА ИССЛЕДОВАНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ И ПРОЦЕССОВ ВИДООБРАЗОВАНИЯ ЭНДЕМИЧНОГО СЕМЕЙСТВА РЫБ ОЗЕРА БАЙКАЛ – ГОЛОМЯНОК (COMEPHORIDAE) 03.00.15 - ГЕНЕТИКА Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Новосибирск 2008 Работа выполнена в лаборатории биологии рыб и водных млекопитающих Лимнологического института СО РАН, г. Иркутск Научный руководитель: кандидат биологических наук Кирильчик Сергей Васильевич Лимнологический институт СО РАН, г. Иркутск Официальные оппоненты: доктор биологических наук Щербаков Дмитрий Юрьевич доктор биологических наук Бородин Павел Михайлович Ведущее учреждение: Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН, г. Иркутск Защита диссертации состоится «__»______________2008 г. на утреннем заседании диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук (Д – 003.011.01) в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале института по адресу: 630090, г. Новосибирск, проспект Лаврентьева, 10, тел/факс: (383)-333-12-78, e-mail: dissov@bionet.nsc.ru С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН. Автореферат разослан «__»_______________2008 г. Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук А.Д.Груздев ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Группы близкородственных видов рыб, таких, как рогатковидные Байкала, обитающие в небольших, относительно замкнутых водоемах могут рассматриваться в качестве удобного объекта для изучения процессов симпатрического видообразования и эволюции в целом. Среди них наиболее интересный пример симпатрических видов демонстрируют голомянки. В открытой пелагиали Байкала обитает два вида рогатковидных рыб - большая (Comephorus baicalensis Pallas, 1776) и малая (C.dybowski Korotneff, 1905) голомянки. Согласно современной классификации голомянки - единственные представители эндемичного рода Comephorus семейства Comephoridae букета видов рогатковидных рыб оз. Байкал. Привлекательность Comephoridae для изучения процессов видообразования у симпатрических видов связана со следующими их особенностями: 1. Голомянки - это близкородственные виды. Согласно молекулярно-генетическим исследованиям время, прошедшее с момента отделения видов от предковой формы, может исчисляться десятками тысяч лет (Kontula et al., 2003). 2. Ареалы обитания видов в значительной степени перекрываются - представители малой и большой голомянок распространены по всему Байкалу, за исключением прибрежной зоны, и встречаются на всех глубинах озера. 3. По сравнению с другими видами байкальских рогатковидных, голомянки наиболее хорошо изучены. Однако, несмотря на многочисленность исследований по голомянкам, до сих пор нет единого мнения об их популяционной структуре. Исследования, проведенные с использованием комплекса морфометрических признаков, не дали конкретного ответа на вопрос о подразделенности на популяции данных видов или ее отсутствии (Коряков, 1964; Стариков, 1977; Аношко, 1998). Остаются, также, неясными причины и время появления двух сестринских видов, роль геологической истории водоема в процессах видообразования. В настоящей работе для исследования внутривидового генетического полиморфизма и процессов видообразования семейства Comephoridae использован анализ полиморфизма микросателлитной ДНК и анализ нуклеотидной последовательности митохондриального гена цитохрома b. Цели и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в исследовании генетического разнообразия и эволюционной истории семейства голомянок (Comephoridae) с помощью молекулярно-генетических методов. В конкретные задачи работы входило: 1. Провести исследования внутривидового генетического полиморфизма двух видов семейства голомянок на основе полиморфизма длин микросателлитных локусов и на основе анализа нуклеотидных последовательностей митохондриального гена цитохрома b. 2. Оценить степень генетической изоляции между особями собранными из разных котловин Байкала - южной, средней и северной. 3. Сравнить результаты анализа внутривидового генетического полиморфизма и межвидовой дивергенции полученные с помощью маркеров микросателлитной и митохондриальной ДНК. 4. Провести оценку времени дивергенции видов и реконструировать эволюционную историю семейства голомянок. Научная новизна. Впервые для популяционно-генетического исследования байкальских организмов применен анализ полиморфизма микросателлитных локусов. Показано, что эти генетические маркеры, разработанные для внебайкальских рогатковидных рыб, могут быть использованы для байкальских видов. Впервые на основе молекулярно-генетических данных определена популяционная структура двух видов семейства голомянок. Исследованы филогенетические взаимоотношения этих видов между собой. С помощью анализа митоходриального гена цитохрома b выявлено наличие двух генетических групп у большой голомянки. Показано происхождение малой голомянки от предковой формы большой голомянки. Сделаны предположения о возможных факторах, имевших место в геологическом прошлом Байкальского региона, которые могли способствовать разделению предковой популяции на генетические группы и виды. Положения, выносимые на защиту.
Научно-практическое значение. Результаты исследований генетического разнообразия и эволюции голомянок могут помочь в понимании особенностей протекания эволюционных процессов в пелагиали озера Байкал, а также процессов микроэволюции в целом. За время работы были определены и депонированы в международную базу данных GenBank 34 нуклеотидных последовательности митохондриального гена цитохрома b малой (номера доступа EU693082 - EU693115) и 37 нуклеотидных последовательностей большой (номера доступа EU699772 - EU699808) голомянок. Проведенные в данной работе выбор, тестирование и оптимизация семи микросателлитных локусов позволят в дальнейшем использовать их для изучения других видов байкальских Cottoidei. Апробация работы и публикации. Результаты работы представлялись: На 3-ем международном совещании: «Видообразование в древних озерах мира» (SIAL) Иркутск, Россия 2002 г.; на региональной научно-практической конференции «Структура и функционирование экосистем Байкальского региона» в г. Улан-Удэ в 2003 г.; на первом Байкальском симпозиуме по эволюционной биологии (BWEB) в Иркутске в 2004 г.; на VIII Всероссийском популяционном семинаре «Популяции в пространстве и времени» в 2005 в Нижнем Новгороде; на Четвертой Верещагинской Байкальской конференции в Иркутске в 2005; на Международной конференции «Проблемы популяционной экологии животных» в г. Томске в 2006 г. По результатам работы опубликовано 8 печатных работ, в том числе две в рецензируемых журналах. Структура и объем диссертации. Работа включает следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение, выводы, список литературы (201 источник). Диссертация изложена на 113 страницах, содержит 18 рисунков и 15 таблиц. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Сбор образцов и выделение ДНК. Образцы малой и большой голомянок были собраны в течение 2000 - 2004 годов. Размер выборок каждого вида из каждой котловины Байкала (Южной, Средней и Северной) составил около 30 особей. Экстракцию проводили стандартным методом, описанным Сэмбруком и соавт. (Sambrook et al., 1989) с некоторыми модификациями. Амплификация ДНК. Микросателлитные локусы амплифицировали методом ПЦР, используя праймеры Cgo56MEHU, Cgo1016PBBE, Cgo1033PBBE, Cgo1114PBBE, Cgo05ZIM, Cgo33ZIM, Cgo42ZIM разработанные для европейского подкаменщика Cottus gobio и описанные в (Englbrecht et al., 1999). Участок ДНК, содержащий последовательность гена цитохрома b, амплифицирован методом ПЦР с использованием праймеров L15361, L15772, L16192, H16170, H16553 (Kontula et al., 2003), H15786 (Kocher et al., 1989) и L16063 5’ TCTTTCCACCCTTACTTTTCTTACAA 3’ (предложен автором). Анализ микросателлитных локусов. Разделение меченных изотопом фосфора 32Р фрагментов микросателлитной ДНК по длине проводили в 6% денатурирующем полиакриламидном геле. Картину, полученную в результате электрофореза, визуализировали на рентгеновской пленке. Для визуализации немеченого маркера молекулярного веса и в случаях, когда радиоактивная метка не использовалась, гель окрашивали серебром (Bassam et al, 1991). Для определения размеров микросателлитных фрагментов использовался маркер молекулярного веса с шагом 25 пн фирмы «Promega», а также набор фрагментов для определения нуклеотидной последовательности ДНК фага M13mp18. Определение нуклеотидных последовательностей митохондриального гена цитохрома b (cytb) проводилось с использованием автоматических секвенаторов ABI 373 и CEQ8800 (Beckman Coulter). Компьютерная обработка данных микросателлитного анализа. Оценку соответствия характера распределения частот генотипов равновесию Харди-Вайнберга проводили с помощью точного теста, предложенного Гуо и Томсоном (Guo, Thomson, 1992). Присутствие “нулевых” аллелей выявляли с помощью программы Micro-Checker (Van Oosterhout, 2004) c использованием оценок Брукфилда (Brookfield, 1996). Наблюдаемую (Hо) и ожидаемую (Hе) гетерозиготности и частоты аллелей рассчитывали в программе POPGENE ver. 1.32 (Yeh, Boyle, 1997). Значения FST (Weir and Cockerham, 1984) и RST (Rousset, 1996;. Michalakis, Excoffier, 1996), отражающие степень подразделенности видов, подсчитывали с помощью программы ARLEQUIN ver.2.000 (Schneider et al., 2000). Наличие или отсутствие стадии «бутылочного горлышка» определяли по стандартным алгоритмам в программе BOTTLENECK ver. 1.2.02 (Cornuet, Luikart, 1996). В программе Population 1.2.28 (Langella, 2002) методом ближайших соседей (NJ) было построено дерево, основанное на полиморфизме микросателлитных локусов малой и большой голомянок. Для построения данного дерева использовались генетические расстояния DAS, основанные на частоте общих аллелей (Chakraborty, Jin, 1993). Компьютерная обработка данных анализа мтДНК. Предварительный анализ нуклеотидных последовательностей, расчет индексов разнообразия гаплотипов (Hd) и уровней нуклеотидной изменчивости (π) осуществляли с использованием программы DnaSP 4.10.3 (Rozas, et. al.2003). Ранее проведенные исследования, показали, что нуклеотидная последовательность гена цитохрома b байкальских рогатковидных при попарном сравнении имеет большое количество несинонимичных замен по сравнению с небайкальскими видами при равном количестве синонимичных точечных мутаций. Для того, чтобы выяснить была ли вызвана дивергенция двух видов голомянок действием какого-либо вида естественного отбора, был проведен тест Макдональда-Крейтмана (McDonald, Kreitman 1991), реализованный в программе DnaSP 4.10.3. Построение медианной сети гаплотипов осуществляли в программе NETWORK 4.5 (Bandelt et al., 1999) с использованием алгоритма соединения медиан (“median-joining”). Анализ молекулярной вариации (АМОВА) проводили с помощью программы ARLEQUIN 2.000 (Schneider et al., 2000). Для АМОВА особи были сгруппированы согласно их выборкам по котловинам. Для оценки эффективного размера (Ne) и времени до наиболее недавнего общего предка (t) использовался метод цепей Маркова и Монте Карло симуляций (MCMC), реализованный в программе IM (Hey и Nielsen, 2004). Дополнительно, оценки времени дивергенции были рассчитаны с помощью программы MEGA 4 (Tamura et al., 2007) на основе генетических расстояний с учетом внутрипопуляционного генетического полиморфизма (Net average distances). Для подсчета генетических расстояний использовался метод Памило-Бьянчи-Ли (Pamilo, Bianchi, 1993; Li, 1993). Поскольку ранее было показано, что несинонимичные замены у байкальских рогатковидных могут накапливаться в ускоренном темпе (Кирильчик, Слободянюк, 1997, Kontula et al., 2003) для оценки времени дивергенции использовалиь только синонимичные замены. Построение филогенетического древа осуществляли баесовским методом с помощью программы MrBayes 3.1.2 (Ronquist, Huelsenbeck, 2003). Тип модели молекулярной эволюции был выбран GTR+I+Γ. В качестве внешней группы использовали нуклеотидные последовательности CytB других видов байкальских рогатковидных рыб, находящиеся в GenBank под номерами AY116341 - AY116354, AY116357 - AY116358 и AY116362 (Kontula et al., 2003). РЕЗУЛЬТАТЫ Анализ полиморфизма микросателлитной ДНК голомянок Для используемых микросателитных локусов подобраны оптимальные условия проведения ПЦР и акриламидного электрофореза и последующей визуализации ДНК. Данное исследование показало, что микросателлитные фрагменты могут быть вполне успешно визуализированы при окраске геля серебром. Вместе с тем, применительно к микросателлитному анализу этот метод имеет как определенные преимущества, так и ряд недостатков и ограничений. Среди преимуществ можно отметить высокую чувствительность, относительную дешевизну и быстроту проявления. Недостатком, по сравнению с использованием радиоактивной метки, является присутствие, в некоторых случаях дополнительных артефактных полос. В результате этого зачастую анализ геля становится практически невозможным (рис. 1).  Рисунок 1. Электрофоретическое фракционирование продуктов ПЦР микросателлитных локусов малой голомянки. А – продукт ПЦР визуализирован с помощью радиоактивной метки; Б – тот же гель после окрашивания серебром. Анализ генетического полиморфизма малой голомянки по микросателлитным локусам. Каждый из семи микросателлитных локусов был протестирован на 82-90 особях малой голомянки. Сравнивались выборки из трех котловин Байкала. Во всех исследованных выборках с использованием χ2-критерия по всем локусам кроме Cgo1016PBBE с высокой достоверностью выявлены отклонения наблюдаемых частот генотипов от теоретически ожидаемых при равновесии Харди-Вайнберга. Причиной этого может быть присутствие неамплифицирующихся «нулевых» аллелей. Наличие «нулевых» аллелей у шести локусов и отсутствие таковых у локуса Cgo1016PBBE показано с помощью программы Micro-Checker. Всего в выборках малой голомянки по шести локусам выявлен 71 аллель, число аллелей в выборке с южного Байкала составило 65, со среднего и северного по 63. Анализ частот аллелей (программа BOTTLENECK) показал их L-образное распределение и отсутствие стадии «бутылочного горлышка» за последние 4Ne поколений. В таблице 1 показаны значения критериев генетической подразделенности Fst и Rst, рассчитанные по каждому локусу отдельно и по совокупности локусов между парами выборок. Наибольшие значения получены для локусов Cgo1016PBBE (Fst = 0.111, Южный Байкал – Средний Байкал и Rst = 0.048, Средний Байкал – Северный Байкал), Cgo42ZIM (Rst = 0.053, Средний Байкал – Северный Байкал) и Cgo1114PBBE (Rst = 0.049, Южный Байкал – Средний Байкал). Однако эти данные не могут быть приняты как показатели популяционной подразделенности. Генетические расстояния для этих локусов показывают, согласно классификации Райта (Wright, 1978) слабую или умеренную генетическую дифференциацию между разными парами выборок из смежных котловин озера, а генетические расстояния между выборками из Южного и Северного Байкала остаются незначительными. Кроме этого, величины одного критерия не отражают степень генетической изоляции, выявленную по другому критерию, - соответствующие генетические расстояния невелики. Значения, полученные по другим локусам индивидуально, а также по совокупности локусов, либо положительны, но очень малы и незначительно отличаются от нуля (P > 0.95), либо отрицательны. |
Похожие:
 |
Блокпост байкал "блокпост байкал", в котором будет даваться полная информация обо всех проверках и контрольных замерах озера байкал. Поводом для... |
|
Исследование генетического полиморфизма исчезающих видов орхидных, занесённых в красную книгу ... |
|
Временная инструкция о мероприятиях по борьбе с миксобактериозами лососевых рыб общие положения Миксобактериозы широко распространенные бактериальные заболевания пресноводных рыб, вызывающие поражения жабр и кожи рыб при их выращивании... |
 |
Владычица озера Едут они дальше и видят озеро, широкое и чистое, а посреди озера, видит Артур, торчит из воды рука в рукаве богатого белого шелка,... |
|
Курсовая работа по дисциплине «Типаж подвижного состава» Исследование истории изменения конструкции системы автомобилей заданного семейства и типа |
|
Временная инструкция о мероприятиях по предупреждению и ликвидации болезней прудовых рыб С целью предупреждения инфекционных и инвазионных болезней рыб в прудовых и других рыбоводных хозяйствах рекомендуется |
|
Временная инструкция Небольшая глубина прудов (до 2 3 м), быстрое прогревание воды выше 17°, обилие промежуточных хозяев, большая концентрация рыб, разновозрастные... |
|
Инструкция о мероприятиях по борьбе с бранхиомикозом рыб общие положения Бранхиомикоз опасное инфекционное (микозное) заболевание рыб разных видов и возрастов, возникающее в прудовых, садковых рыбоводных... |
|
М. Д. Махлин (среда обитания, обзор рыб и растений) Ю. А. Митрохин (корма и кормление, как создается новое); Г. Л. Куприянов (практика аквариумной гидрохимии); канд биол наук А. Е.... |
|
Инструкция для применения косметической маски «гея» на основе иловой... Сверху защищена от активного окисления слоем жидкости, легко смешиваемой перед применением с основной субстанцией. Содержит комплекс... |
|
Ооо «Байкал Аква Трейд», именуемое в дальнейшем «Арендодатель» Ооо «Байкал Аква Трейд», именуемое в дальнейшем «Арендодатель», в лице Генерального директора Кузнецова И. В., действующего на основании... |
|
Направление : Физика Тема: «Моделирование траектории космических полётов с помощью компьютера» Ещё одно открытие – не известные ранее озёра в горах Ирана. Дело в том, что в результате деятельности человека и природных процессов... |
|
• Исследование электромагнитных процессов в заземлителях электроустановок в условиях вусг Повышение надежности защиты от перенапряжений систем электроснабжения нефтяной промышленности в районах с высоким удельным сопротивлением... |
|
Исследование геодинамических процессов в зоне возникновения ожидаемых... Исследование геодинамических процессов в зоне возникновения ожидаемых землетрясений на Северном Кавказе с использованием уникальной... |
|
Исследование структуры интеллекта личности Определенное превосходство по результатам tsi могут иметь в одной и той же возрастной группе лица с более высокой образованностью,... |
|
Исследование №2 30 Исследование №3 31 Исследование №4. Создание сайта... Поэтому школьнику необходимо не только усвоить основные понятия и положения теории экономики, но и научится применять полученные... |