На правах рукописи
Рыбакова Юлия Сергеевна
АНТИПРОЛИФЕРАТИВНОЕ ДЕЙСТВИЕ КАРНОЗИНА И ЕГО ПРОИЗВОДНЫХ
НА ОПУХОЛЕВЫЕ КЛЕТКИ НЕЙРАЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ
03.01.04 – биохимия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Москва - 2013
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении
«Научный центр неврологии»
Российской академии медицинских наук
Научный руководитель: доктор биологических наук,
Федорова Татьяна Николаевна
Официальные оппоненты: Гривенников Игорь Анатольевич, доктор биологических наук, профессор, заведующий лабораторией молекулярной генетики соматических клеток Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной генетики Российской академии наук
Онуфриев Михаил Валерьевич, доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории функциональной биохимии нервной системы Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии Российской академии наук
Ведущая организация: Научно-исследовательский институт клинической онкологии Федерального государственного бюджетного учреждения «Российский онкологический научный центр имени Н. Н. Блохина» Российской академии медицинских наук
Защита состоится «___» _____________ 2014 г. в 14 ч 00 мин. на заседании
Диссертационного Совета Д 001.002.01 в ФГБУ «НИИ питания» РАМН по адресу:
Москва, Устьинский проезд, д.2/14
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИ питания» РАМН.
Автореферат разослан ___ декабря 2013 г.
Ученый секретарь
Диссертационного совета
доктор биологических наук, профессор В.М.Коденцова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность исследования. Карнозин представляет собой природный дипептид, состоящий из двух аминокислот – β-аланина и L-гистидина. В организме человека карнозин представлен во многих тканях, достигая наивысшей концентрации в мышцах (~ 20 мM) и головном мозге (~ 2.5 мM) (Margolis 1974, Mannion et al 1992). Карнозин синтезируется ферментом карнозин-синтетазой, которая катализирует образование пептидной связи между β-аланином и L-гистидином, используя энергию АТФ и ионы Mg2+ (Horinishi et al 1978, Drozak et al 2010). Разрушение карнозина на составляющие его аминокислоты осуществляется главным образом сывороточной карнозиназой (CN1) (Hanson & Smith 1949, Teufel et al 2003). Карнозин демонстрирует многообразие функций, в том числе: протонный буфер в скелетных мышцах (Северин С. Е. 1953), хелатор двухвалентных металлов (Cu2+, Zn2+, Fe2+) (Boldyrev, 2012), антиоксидант (Dupin et al 1984, Kohen et al 1988, Chan et al 1994, Zhou & Decker 1999) и ингибитор пролиферации опухолевых клеток (Nagai and Suda 1986, Holliday and McFarland 1996, Renner et al 2010).
Впервые антипролиферативный эффект карнозина на опухолевые клетки описали Nagai и Suda в 1986 году. В их работе подкожные инъекции карнозина мышам линии ddY, с предварительно вживленными клетками саркомы, способствовали снижению интенсивности пролиферации опухолевых клеток и увеличению выживаемости животных. Позже в независимом исследовании Renner et al. (2010) на мышах с ксенографтами HER2/neu NIH3T3 фибробластов было показано, что ежедневные внутрибрюшинные инъекции карнозина существенно подавляют пролиферацию злокачественных клеток и опухолевый рост. Holliday и McFarland (1996) продемонстрировали избирательность действия карнозина на опухолевые клетки. Добавление карнозина к смеси клеток карциномы шейки матки (HeLa) и нормальных человеческих фибробластов (MRC-5) приводило к выборочному уничтожению опухолевых клеток и удлиняло продолжительность жизни фибробластов. Таким образом, на сегодняшний день накоплено достаточно экспериментальных данных об ингибирующем действии карнозина на пролиферацию опухолевых клеток, однако механизм противоопухолевого эффекта до сих пор остается не выясненным.
В настоящее время участие активных форм кислорода (АФК) и антиоксидантов в регуляции клеточной пролиферации хорошо обосновано и изучено (Menon and Goswami 2007, Burhans and Heintz 2009). Показано, что быстро пролиферирующие опухолевые клетки часто характеризуются более высоким содержанием АФК и пониженной активностью антиоксидантной системы по сравнению с нормальными клетками, делящимися медленно или находящимися в состоянии покоя (Goswami et al 2000, Sarsour et al 2012). Добавление небольших концентраций пероксида водорода к опухолевым клеткам активировало пролиферативные процессы, а повышение экспрессии антиоксидантного фермента митохондриальной супероксиддисмутазы, наоборот, пролиферацию замедляло (Laurent et al 2005, Weydert et al 2006). Карнозин демонстрирует эффективные антиоксидантные свойства, которые заключаются в его способности образовывать комплексы с двумя высоко реакционноспособными окислителями – гидроксильным радикалом и супероксидным анионом, снижая их реактивность и предотвращая дальнейшее распространение окислительного повреждения (Chan et al 1994, Klebanov et al 1997). Кроме того, в нескольких независимых исследованиях было продемонстрировано эффективное подавление накопления продуктов перекисного окисления липидов в присутствии карнозина, что снижало уровень окислительного повреждения макромолекул, способствуя сохранению их структуры и функций (Dupin et al 1984, Kohen et al 1988, Zhou and Decker 1999). Исходя из литературных данных, мы предположили, что ингибирующий эффект карнозина на пролиферацию опухолевых клеток может быть опосредован его антиоксидантными свойствами.
Работа выполнена в соответствии с планом НИР ФГБУ «НЦН» РАМН в рамках темы №146 «Исследование в условиях in vitro и in vivo проблем эффективности безопасности наноструктурных комплексов, обладающих нейропротекторным действием».
Цель исследования. Изучение механизма антипролиферативного действия карнозина и его производных на опухолевые клетки нейрального происхождения.
Задачи исследования:
1. Изучить характер воздействия карнозина на пролиферацию линий опухолевых клеток феохромоцитомы крысы (РС-12), карциномы горла и рта (FaDu, Cal27), карциномы молочной железы (MB231) и глиобластомы человека (U-118-MG);
2. Выявить, сопровождаются ли индуцируемые карнозином изменения пролиферации опухолевых клеток колебаниями внутриклеточного уровня АФК и антиоксидантных ферментов;
3. Выяснить, являются ли индуцируемые карнозином изменения пролиферации опухолевых клеток результатом модификации прогрессии клеточного цикла;
4. Сравнить антипролиферативные свойства карнозина с действием его производных.
5. Оценить эффект совместного применения карнозина и ионизирующего излучения на гибель опухолевых клеток.
Научная новизна. Настоящая работа представляет собой оригинальное экспериментальное исследование, в котором было впервые показано избирательное подавление пролиферации клеток глиобластомы под действием карнозина. Установлено, что замедление пролиферации глиобластомы сопровождается накоплением клеток в G2 фазе клеточного цикла и активацией экспрессии циклина B1. Продемонстрировано, что параллельно с изменениями в прогрессии клеточного цикла происходит повышение активности MnСОД и понижение внутриклеточного уровня АФК. Выявлено, что метилированное производное карнозина – анзерин – подавляет пролиферацию глиобластомы эффективнее, чем карнозин. Показано, что предварительная инкубация клеток с карнозином снижает выживаемость клеток глиобластомы под действием ионизирующего излучения.
Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные результаты существенно расширяют представления о природе антипролиферативного действия карнозина на опухолевые клетки нейрального происхождения, что важно для понимания молекулярных механизмов действия карнозина в целом. Полученные в работе данные об эффекте совместного действия карнозина и ионизирующего излучения на выживаемость клеток глиобластомы открывают перспективу для применения карнозина в комбинированной терапии опухолей головного мозга.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Карнозин ингибирует пролиферацию опухолевых клеток нейрального происхождения, при этом наиболее выраженный эффект проявляется на клетках глиобластомы человека U-118-MG;
2. Ингибирование пролиферации клеток глиобластомы под действием карнозина сопровождается снижением уровня АФК и увеличением активности MnСОД;
3. Изменения в антиоксидантной системе клеток глиобластомы сопровождаются накоплением клеток в G2 фазе клеточного цикла и усилением экспрессии циклина В1;
4. Метилированное производное карнозина, анзерин, ингибирует пролиферацию клеток глиобластомы эффективнее, чем карнозин;
5. Предварительная инкубация клеток с карнозином снижает выживаемость клеток глиобластомы под действием ионизирующего излучения.
Протокол диссертационного исследования «Антипролиферативное действие карнозина и его производных на опухолевые клетки нейрального происхождения» был одобрен локальным этическим комитетом ФГБУ «НЦН» РАМН. Протокол №12/13 от 11 декабря 2013 г.
Апробация работы. Диссертация апробирована и рекомендована к защите на совместном заседании научных сотрудников ФГБУ «Научный центр неврологии» РАМН. Протокол № 11 от 18 октября 2013 г.
Материалы диссертационной работы были представлены на 2 международных конференциях: V Stromboli Conference on Cancer and Ageing: “The Primeval Life-Generating Molecules. Therapeutic and Aging-Reversing Properties” (Стромболи, Италия, 2010) и The 4th Quadrennial Meeting of the World Federation of Neuro-Oncology held in conjunction with the 2013 SNO Scientific Meeting and Education Day (Сан-Франциско, США, 2013)
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 научные работы, из них 1 публикация в изданиях, рекомендуемых ВАК Министерства образования и науки РФ и 2 работы в зарубежных рецензируемых журналах.
Личный вклад автора. Автором лично выполнено культивирование клеточных линий и исследования клеточной пролиферации, проведено измерение уровня АФК, доли мертвых клеток, а также анализ клеточного цикла, определена активность и экспрессия антиоксидантных ферментов. Выполнена последующая аналитическая обработка и обобщение полученных результатов, сформулированы выводы и подготовлены публикации.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов, их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа содержит 120 стр. машинописного текста, 1 таблицу и 29 рисунков. Список литературы включает 271 источник (18 отечественных и 253 зарубежных).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
Культуры клеток. В работе были использованы следующие клеточные линии: феохромоцитома крысы (РС-12); карцинома горла и рта (FaDu, Cal27), карцинома молочной железы (MB231) человека; глиобластома человека (U-118-MG). Клетки PC-12 культивировали в среде RPMI 1640 с добавлением HEPES, бикарбоната натрия, глутамина, гентамицина и эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) (ПанЭко, Россия). Клетки FaDu и Cal27 культивировали в среде DMEM (Gibco, США) с добавлением ПенСтреп и ЭТС (HyClone, США). Клетки MB231 инкубировали в среде RPMI 1640 (Gibco, США) с добавлением ЭТС и ПенСтреп. Клетки U-118-MG культивировали в смеси DMEM:F12 (1:1) с добавлением HEPES, ПенСтреп, пирувата натрия (Gibco, США), инсулина (Sigma Aldrich, США), фактора роста фибробластов (Sigma Aldrich, США) и ЭТС. Клетки содержали в СО2-инкубаторе (ShelLab, США) в присутствии 5% СО2, 98% влажности и 37˚С.
Исследуемые соединения: Карнозин и гомокарнозин (чистота 99%) «Hamari Chem., LTD», анзерин (чистота 99%) «Yaizu Suisankagaku Industry Co.,Ltd.», N-ацетилкарнозин (чистота 98,7%) был синтезирован рутинным путем в лаборатории клинической и экспериментальной нейрохимии ФГБУ «НЦН» РАМН.
Исследование пролиферации клеток FaDu, Cal27, MB231 и U-118-MG, двухпараметрический анализ клеточного цикла, определение активности MnСОД, иммуноблоттинг, ПЦР в реальном времени были выполнены в лаборатории Доктора П.С. Госвами (P.C. Goswami) Университета Айовы (Айова Сити, США) в рамках стажировки по гранту Fulbright Foreign Student Program (№15121424).
Исследование клеточной пролиферации. Клетки высаживали в чашки Петри и каждые два дня считали их количество с помощью Z1 Coulter Counter (Beckman Coulter, США). Время удвоения популяции (doubling time, Тd) рассчитывали на экспоненциальном участке кривой роста по формуле: Тd=0.693t/ln(Nt/N0), где t – время (дни), N0 – начальное количество клеток, Nt – количество клеток ко дню t. Выживаемость рассчитывали как процентное соотношение эффективности посева (ЭП) в клетках, обработанных карнозином, к ЭП клеток в контроле.
Проточная цитометрия. Все измерения проводили на проточном цитометре FACSCalibur (BD, США), оснащенном ионным аргоновым лазером с длинной волны 488 нм и двумя светофильтрами: 585/42 нм для красной флуоресценции (PI) и 530/30 нм для зеленой флуоресценции (ФИТЦ, DCF). Из каждой пробы было проанализировано 10 000 событий.
Определение доли мертвых клеток. Клетки инкубировали с 1 мкМ йодида пропидия (PI) (Invitrogen, Germany) в течение 3 мин в темноте при комнатной температуре. Данные обрабатывали в программе Cell Quest Pro (BD, США) и рассчитывали среднее значение интенсивности флуоресценции в Microsoft Exel (Microsoft, США).
Измерение уровня АФК. Клетки инкубировали 30 мин в 100 мкМ 2,7-дихлордигидрофлуоресцеин-диацетат (DCFН2-DA) (Biotium, США) в темноте при 37оС. Данные обрабатывали в программе CellQuest Pro (BD, США). Результаты представлены в виде среднего значения интенсивности флуоресценции.
Анализ клеточного цикла. Фиксированные в 70% этаноле (- 4оС) клетки инкубировали РНКазой (Invitrogen, Germany) и PI (Invitrogen, Germany) в темноте. Данные обрабатывали с помощью программы ModFit LTTM(BD, США).
Двухпараметрический анализ клеточного цикла (Menon et al 2003, Sarsour et al 2005). Клетки инкубировали 30 мин с 5-бромдезоксиуридином (БДУ) (37 оС) и фиксировали в 70% этаноле (- 4оС). Фиксированные клетки инкубировали в пепсине, нейтрализовали в боратном буфере, центрифугировали, осадок инкубировали с мышиными антителами против БДУ (1:10, BD, США), и затем с антимышиными козьими ФИТЦ-коньюгированными антителами (1:10, BD, США). Далее подготавливали клетки для анализа клеточного цикла по протоколу, описанному выше. Данные обрабатывали в программе FlowJo v8.8.7.
Иммуноблоттинг. Для выделения белков клетки разрушали с помощью ультразвука в лизирующем буфере, содержащем фосфатный буфер (pH 7.8), ингибитор фосфатаз (PhosSTOP, Roche, США), коктейль ингибиторов протеаз (Sigma, США), 2% NP-40 и ДНКазу (0.01 ед/мкл, Zimo Research Corp., США). Белки разделяли в 12% полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия и переносили с помощью полусухого электротранспорта на нитроцеллюлозную мембрану. Мембраны инкубировали с антителами против MnСОД (1:1000, Millipore, США), циклина B1 (1:1000, BD, США), НАДФН (1:500, BD, США) и актина (1:1000, Millipore, США). В качестве вторичных антител были использованы: меченные пероксидазой хрена антимышиные овечьи антитела (1:5000, GE Healthcare, США) и антикроличьи ослиные антитела (1:10,000, GE Healthcare, США). Иммунореактивные полоски визуализировали с помощью набора Pierce ECL 2 Western Blotting Substrate (Thermo Scientific, США) согласно инструкции производителя и детектировали с помощью Typhoon FLA 7000 (General Electric, США). Интенсивность полос анализировали в программе ImageJ (NIH, США). Нормирование количества белка проводили на уровень актина и НАДФН.
Определение активности MnСОД. Нативный белок разделяли c помощью неденатурирующего электрофореза в 12.5% полиакриламидном геле. Активность MnСОД определяли по методу предложенному ранее (Sarsour et al 2008, Weydert et al 2003). Гель сканировали с помощью Epson Perfection 4990 PHOTO и анализировали интенсивность полос в программе ImageJ (NIH, США).
ПЦР в реальном времени. РНК выделяли с помощью набора «Direct-zolTM RNA MiniPrep Kit», согласно инструкции производителя (Zimo Research Corp., США). Комплементарную ДНК синтезировали с помощью набора «High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit» (Applied Biosystems, США). Измерение уровня РНК проводили с помощью метода ПЦР в реальном времени (Applied Biosystems, США), используя последовательности праймеров, представленных в Таблице 1. Данные анализировали в программе StepOne Software v2.2 (Applied Biosystems, США) и Microsoft Excel (Microsoft, США). Результаты представлены в виде значений относительной экспрессии (2−ΔΔCT).
Ген
|
Gene Bank No.
|
Последовательность (5’ 3’)
|
Размер ампликона (п.о.)
|
CCNB1
(циклин В1)
|
NM_031966.3
|
Forward: TAGCACTGAAAATTCTGGATAATGGTGA
Reverse: TTGATTTACCATGACTACATTCTTAGCCAG
|
125
|
ACTB
(актин В)
|
NM_001101.3
|
Forward: TCACCATTGGCAATGAGCGGTT
Reverse: AGTTTCGTGGATGCCACAGGACT
|
89
|
CRNS1
(карнозин-синтетаза)
|
NM_001166222.1
|
Forward: AAGCTGGAGGAGGAGGAGAGTGTC
Reverse: CCTTGCTCAGCAGTGGCCTATCA
|
154
|
CNDP1
(карнозиназа)
|
NM_032649
|
Forward: CAGCAATCACTTACGGAACCCG
Resverse: CCGAGAAGAGCAACCAGATCAGC
|
133
|
MnСОД
|
NM_000636.2
|
Forward: TTGGCCAAGGGAGATGTTAC
Reverse: AGTCACGTTTGATGGCTTCC
|
157
|
Статистическая обработка результатов. Результаты измерений, проведенных в 3-5 параллельных пробах, представлены в виде «среднее значение ± стандартное отклонение». Статистическая значимость определяли с помощью одномерного дисперсионного анализа с последующим тестом на наименьшую значимую разность и тестом на взвешенное среднее Тьюки. Данные тесты используются для сравнения и определения разницы между и в пределах групп данных в зависимости от значений среднего и среднеквадратических ошибок для каждой переменной. Гомогенность дисперсии бралась в пределах доверительного интервала в 95%. Результаты со значениями р<0.05 принимались как статистически значимые.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
|
