Введение гена каталитического компонента теломеразы (htert) в клетки с различным дифференцировочным потенциалом
|
Скачать 316.22 Kb.
|
| На правах рукописи ДАШИНИМАЕВ ЭРДЭМ БАИРОВИЧ Введение гена каталитического компонента теломеразы (hTERT) в клетки с различным дифференцировочным потенциалом Специальность 03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2009 Работа выполнена в лаборатории молекулярной кариологии и основ клеточной терапии Учреждения Российской академии наук Института молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН. Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Егоров Егор Евгеньевич Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Кузин Борис Александрович кандидат биологических наук Лупатов Алексей Юрьевич Ведущая организация: Биологический факультет Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова Защита состоится _______________________2009 г. в________ часов. на заседании Диссертационного совета Д 002.238.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биологии развития им Н.К. Кольцова РАН по адресу 119334, Москва ул. Вавилова, д. 26 http://idbras.comcor.ru/ idbras@bk.ru С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН (119334, Москва, ул. Вавилова, д. 26.) и на сайте института http://idbras.comcor.ru/ Автореферат разослан «_____» __________________ 2009 г. Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук Е.Б. Абрамова ele0806@yandex.ru ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы В настоящее время одними из наиболее бурно развивающихся направлений в медицине являются клеточнозамещающие технологии - клеточные трансплантации и тканевая инженерия. Эти технологии применяются для лечения заболеваний, связанных с повреждением или дегенерацией различных типов тканей. Предполагается, что в качестве замещающего материала наиболее оптимальным будет использование стволовых клеток, то есть клеток способных дифференцироваться в клетки различных типов тканей. Во избежание иммунных конфликтов для подобного рода трансплантаций наиболее целесообразно использовать аутологичные стволовые клетки человека. Поэтому в настоящий момент во всем мире проводится большое количество исследований по поиску способов выделения, культивирования и наращивания аутологичного донорского клеточного материала in vitro, а также ведется изучение механизмов дифференцировки стволовых клеток и способов создания тканевых трансплантатов для дальнейшего использования в медицине. Одной из главных проблем, связанных с культивированием и наращиванием стволовых клеток in vitro, является то, что практически все первичные культуры клеток, получаемые из тканей взрослого человека, имеют ограниченный пролиферативный потенциал и быстро теряют способность к дифференцировке. В то же время во множестве работ было показано, что введение в культивируемые клетки гена каталитического компонента теломеразы (hTERT), восстанавливает теломеразную активность внутри клетки, стабилизирует теломерные участки хромосом и значительно увеличивает время жизни клеток в культуре, позволяя получать иммортализованные клеточные линии. Цели и задачи исследования Цель настоящей работы заключалась в исследовании возможности получения иммортализованных культур стволовых клеток человека при помощи введения гена каталитического компонента теломеразы, а также в изучении характера влияния экспрессии гена hTERT на способность клеток к дифференцировке. В ходе работы предполагалось решить три основные задачи: 1) Определить на каком этапе происходит остановка пролиферации клеточных культур с введенным геном hTERT и интактных клеточных культур. 2) Охарактеризовать влияние экспрессии гена hTERT на способность стволовых клеток, выделенных из различных тканей, к разным типам дифференцировок. 3) Определить, сохраняется ли теломеразная активность в иммортализованных клетках и не приобретают ли они признаков, характерных для злокачественно-трансформированных культур. Научная новизна и практическая значимость Ген hTERT в составе лентивирусной конструкции был трансфицирован в три различные первичные культуры мезенхимальных клеток человека: а) мезенхимальные стромальные клетки (МСК) костного мозга, б) клетки стромы губчатой кости, в) МСК жировой ткани. Было показано, что во всех трех случаях введение гена hTERT позволяет получить иммортализованные линии клеток или, по крайне мере, значительно увеличить их пролиферативный потенциал. Также впервые была получена и охарактеризована иммортализованнная культура нейральных стволовых клеток (НСК) человека. Пролиферация иммортализованых НСК была прослежена до уровня свыше 100 удвоений популяций (УП), (500 дней непрерывного культивирования). Нами было показано, что после прохождения предела Хэйфлика трансфицированные клетки не изменяли морфологию, сохраняли прежнюю скорость роста и не теряли способность к дифференцировкам. Также трансфицированные клетки сохраняли нормальную способность переходить в состояние покоя в результате сывороточного голодания, способность к контактному торможению и нормальный диплоидный кариотип. Результаты данной работы способствуют расширению знаний о функциях hTERT и его роли в процессе иммортализации клеточной культуры. Практическая значимость данной работы заключается в отработке методов получения иммортализованных культур стволовых клеток человека, не отличающихся по своим свойствам от первичных культур стволовых клеток, что может найти применение в клеточной терапии. Апробация работы Основные материалы диссертации были представлены на Всероссийской конференции «Перспективы фундаментальной геронтологии» (Санкт-Петербург, 2006); на 50-й научной конференции МФТИ «Современные проблемы фундаментальных и прикладных наук» (Долгопрудный, 2007); на V-ой Конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2008); и на научных коллоквиумах лаборатории молекулярной кариологии и основ клеточной терапии Учреждения Российской академии наук Института молекулярной биологии им В.А.Энгельгардта (2004-2008). По материалам диссертации опубликовано три статьи в рецензируемых журналах. Личное участие автора Автор освоил все экспериментальные методы, используемые в данной работе, основные результаты исследования были получены им лично. Структура и объем работы Диссертация состоит введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Список литературы содержит 207 наименований, из них 198 иностранных источников. Работа изложена на 119 страницах, и содержит 33 рисунка и 2 таблицы. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Культуры клеток Первичная культура мезенхимальных стромальных клеток костного мозга человека (X1), была получена из мононуклеарной фракции аспирата костного мозга подвздошной кости человека. Клетки культивировали на среде DMEM с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS), 0,32 мг/мл глутамина, 40 ед/мл гентамицина. Первичная культура клеток стромы губчатой кости человека (BMSCS), полученная из трепаната верхней челюсти, была любезно предоставлена С.М. Тереховым (МГНЦ РАМН). Клетки культивировали на среде DMEM с добавлением 10% FBS, 0,32 мг/мл глутамина, 40 ед/мл гентамицина. Первичная культура мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека (LA) была любезно предоставлена С.М. Тереховым. Клетки культивировали в среде DMEM с добавлением 15% FBS и 0,32 мг/мл глутамина, 40 ед/мл гентамицина. Первичная культура фетальных нейральных стволовых клеток человека (NSC) была любезно предоставлена И.Н. Сабуриной (ИБГ РАН). Клетки культивировали на среде DMEM/F12 с добавлением 2% Fetal Clone III, 10 нг/мл FGF-2, 10 нг/мл EGF, 0,11 мг/мл пирувата натрия, N2 Supplement, 0,32 мг/мл глутамина, 40 ед/мл гентамицина,. Клетки линии TK-164 (почечная карцинома человека) были любезно предоставлены М.Кост-Алимовой (Каролинский институт, Швеция). Клетки TK-164 культивировали в среде DMEM с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 0,32мг/мл глутамина и 40ед/мл гентамицина. Все типы клеток культивировали в СО2-инкубаторе с пониженным содержанием кислорода, в условиях +37С, 5%СО2, 3%О2. Трансфекция гена каталитического компонента теломеразы Л  ентивирусная конструкция, содержащая ген hTERT под CMV промотором была любезно предоставлена П.М. Чумаковым (ИМБ РАН) (Рис. 1).Введение гена осуществляли в растущие клетки. После удаления культуральной среды к растущим во флаконах клеткам на стадии половины монослоя добавляли вирусный концентрат (1 мл с титром 108/мл), разведенный полной ростовой средой с сывороткой в соотношении 1:2. Эта смесь содержала также 5 мкг/мл полибрена. Клетки инкубировали в течение ночи, после чего среду меняли на полную ростовую среду. Эффективность лентивирусной трансфекции (по параллельному введению конструкции с зеленым флуоресцирующим белком) составляла не менее 80%. Анализ дифференцировки клеток и иммуноцитохимические методы Для индукции клеток к дифференцировке в адипогенном направлении, использовали полную ростовую среду (DMEM, 10%FBS) с добавлением 1 мкM дексаметазона, 0,5 мM 3-изобутил-1-метилксантина и 1 мкг/мл инсулина. Среду меняли через каждые 3-4 дня. Образование характерных жировых клеток начиналось через 7-10 дней от начала дифференцировки. После 21 дня культивирования с индукционной средой клетки промывали фосфатно-солевым буфером (PBS), фиксировали 4% формальдегидом 10 мин при комнатной температуре, после чего опять промывали PBS и окрашивали Суданом-IV 10 мин при комнатной температуре. Для индукции клеток к дифференцировке в остеогенном направлении мы использовали полную ростовую среду (DMEM, 10%FBS) с добавлением 0,1 мкM дексаметазона, 10 мM β-глицерофосфата, 100 мкМ фосфата аскорбиновой кислоты. Среду меняли каждые 3-4 дня. После 14 дней культивирования с индукционной средой клетки промывали PBS, фиксировали 4%-ым формальдегидом 10 мин при комнатной температуре, промывали PBS и окрашивали 2% Ализариновым красным (pH 4.2) 10 мин при комнатной температуре. Анализировали клетки при помощи инвертированного фазово-контрастного микроскопа Diaphot (“Nikon”, Япония) и цифрового фотоаппарата Nikon D70. Иммуноцитохимия. Клетки высаживали на покровные стекла в 6-луночных или 24-луночных планшетах (Costar, США). Перед фиксацией стекла с клетками дважды промывали PBS, фиксировали 4% формальдегидом в течение 30 минут при комнатной температуре, затем дважды промывали PBS. Перед окрашиванием антителами стекла в течение 2 часов при комнатной температуре обрабатывали блокирующим раствором (PBS c добавлением 10% FBS, 0,1% Triton-X-100, 0,01% Tween-20). Наносили первые моноклональные антитела (разведенные в концентрации 1/100-1/500 от стоковой), инкубировали 2 часа при +37С и промывали 3 раза PBS. Затем наносили вторые антитела с флуоресцентным красителем (разведенными в концентрации 1/500-1/1000 от стоковой), инкубировали 1 час при +37С и отмывали 3 раза PBS. Далее препараты с клетками окрашивали раствором Хехста (3 мкг/мл на PBS) или DAPI (1,5 мкг/мл на PBS) 15 мин при комнатной температуре, промывали дистиллированной водой и заключали в 85% глицерин на PBS. Фотографировали препараты с помощью флуоресцентного микроскопа Olympus BX61 и инвертированного флуоресцентного микроскопа Olympus CKX41. Выявление белкового компонента теломеразы in situ. Для иммунохимического анализа клеток на экспрессию белка каталитического компонента теломеразы использовались моноклональные мышиные IgM антитела ab5181 фирмы Abcam (Англия). Процедуру окрашивания антителами проводили в соответствии с инструкцией производителя. Изучение кариотипа Для приготовления хромосомных препаратов из митотических клеток человека использовали культуры клеток, находящихся в активном делящемся состоянии, с наибольшим количеством митозов (обычно на 2-ой день после пересева). В начале процедуры клетки инкубировали в присутствии 0,1 мкг/мл колцемида в течении 2 часов, затем клетки снимали при помощи раствора трипсин-Версена, осаждали центрифугированием, промывали PBS и инкубировали в гипотоническом растворе 60 мM KCl при +37ºС в течении 1 часа с последующим осаждением на центрифуге. Далее клетки фиксировали в охлажденном до +4ºС фиксирующем растворе (ледяная уксусная кислота/метиловый спирт, 1:3) в течение 10 мин и меняли фиксирующий раствор на свежий. Полученную суспензию раскапывали на охлажденные до -20ºС предметные стекла с высоты 30 см, с последующим поджиганием фиксатора на стекле. Эта методика позволяет добиться оптимального распластывания митотических пластинок на поверхности предметного стекла. Полученные хромосомные препараты хранили сухими при комнатной температуре. Дифференциальное R-окрашивание хромосом. Хромосомные препараты были окрашены при помощи флуоресцентных красителей: 4,6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) и 7-амино-актиномицина D (7-ААD). Для окрашивания хромосомных препаратов использовали рабочий раствор 7-ААD концентрацией 5 мкг/мл на PBS без кальция и магния, окрашивали в течение 30 мин, при комнатной температуре. Затем окрашивали раствором DAPI (5 мкг/мл на PBS) в течение 15 мин при комнатной температуре. Далее препараты промывали дистиллированной водой и заключали под покровные стекла в 85% глицерин на PBS. Окрашенные препараты анализировали при помощи флуоресцентного микроскопа Olympus BX61. Полученная флуоресцентная окраска соответствует стандартному дифференциальному R-окрашиванию хромосом. Определение экспрессии генов, методом ОТ-ПЦР Выделение РНК. Для выделения РНК использовали коммерческий набор Invisorb®Spin Cell RNA Mini Kit, фирмы Invitek (Германия). На выходе данной процедуры получали выделенную и очищенную от ДНК тотальную РНК клеток в количестве 1-2 мкг/1 млн клеток. Обратная транскрипция. Обратную транскрипцию мРНК осуществляли при помощи набора для синтеза первой цепи кДНК (олиго(dT)15) фирмы ЗАО «Силекс» (Россия, Москва). ПЦР. Для проведения ПЦР исследуемых генов использовали коммерческий набор JumpStart Taq Ready Mix, D#7440, фирмы Sigma (США). Смесь полученного амплификата хранили при –20ºС и в дальнейшем анализировали при помощи стандартного агарозного гель-электрофореза. Интернет-адреса банков праймеров, где были подобраны последовательности: http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/index.html http://medgen.ugent.be/rtprimerdb/ Идентификационные номера использованных праймеров: GAPDH (Primer Bank ID: 7669492a2), Nestin (PrimerBank ID: 35019a2), NSE (Primer Bank ID: 5803011a2), TH (RTPrimerDB ID: 3510), CHAT (RTPrimerDB ID: 3502), GFAP (PrimerBank ID: 4503979a1), PLP (Primer Bank ID: 19923104a1). Определение теломеразной активности. Для определения теломеразной активности использовали коммерческий набор «Trapeze Gel-Based Telomerase Detection Kit Assay» фирмы Chemicon, (США). Данный набор использует стандартный метод выявления теломеразной активности TRAP (telomeric repeat amplification protocol). Результаты реакции TRAP выявляли при помощи вертикального 10% ПААГ-электрофореза, в стандартном TBE буфере. Гель окрашивали бромистым этидием 0,5 мкг/мл – в течение 30 мин при покачивании, фотографировали через красный интерференционный светофильтр, с помощью цифровой камеры Nikon D70. Источником возбуждающего света УФ служил транс-иллюминатор. Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) теломерного повтора на хромосомах человека. Хромосомные препараты получали по ранее описанной методике. Олигонуклеотиды (СССТАА)4, меченные биотином, были заказаны в фирме «Силекс» (Россия). Хромосомные препараты обрабатывали раствором РНКазы А (10 мкг/мл) в течении 1 часа при 37ºС, после чего отмывали в PBS и высушивали на воздухе. Гибридизационный буфер с биотинилированными олигонуклеотидами (10-25 нг/мл меченых олигонуклеотидов, 50% формамида и 10% декстрансульфата в 2X буфере SSC) наносили на препараты в количестве 20мкл и накрывали покровным стеклом. Затем препараты нагревали до +80°С 4 мин (этап денатурации) и инкубировали ночь при +37°С (этап гибридизации) во влажной камере. После этого препараты промывали 3 раза гибридизационным буфером при 42°С. Для выявления биотина использовали коньюгат стрептавидина с флуоресцентным красителем Cy-3. Хромосомы окрашивали DAPI по описанной ранее методике. Тест на наличие контактного торможения пролиферации и реакции на сывороточное голодание. Тест на контактное торможение пролиферации клеток проводили следующим образом: клетки высевали в 9 флаконов площадью 25 см2, в количестве 100 тыс. клеток на флакон и культивировали в обычной полной ростовой среде, меняя среду через 3-4 суток. В процессе культивирования через каждые 2-3 суток (в зависимости от скорости роста культуры) из эксперимента выводили один флакон и подсчитывали количество клеток. Результатом теста является график роста культуры в зависимости от времени. Рост культуры клеток со способностью к контактному торможению имеет вид кривой «выходящей на плато». Тест на наличие способности перехода в покой в условиях сывороточного голодания проводили следующим образом: клетки высевали в 7 чашек Петри диаметром 3 см, количеством 10 тыс. клеток на чашку в полной ростовой среде. На следующий день три чашки Петри (опытная группа) промывали 2 раза PBS и заливали средой DMEM с 0,2% FBS, три чашки Петри (контрольная группа) промывали 2 раза PBS и заливали полную ростовую среду (с 10% FBS). Оставшуюся одну чашку Петри выводили из эксперимента и фиксировали клетки 4% формальдегидом. Далее выводили из эксперимента по одной чашке Петри в день из опытной и контрольной группы и фиксировали клетки 4% формальдегидом, смены среды в эти дни не проводили. Иммуноцитохимическим методом выявляли долю клеток экспрессирующих Ki-67, т.е. клеток, находящихся в активной фазе клеточного цикла. Результатом теста является график, показывающий долю Ki-67+ клеток, в контрольной и опытной группах в зависимости от времени. |
Похожие:
 |
Экзаменационные тесты для студентов лечебного факультета I курс по... Дополнение к клеточной теории о происхождении каждой клетки из другой клетки сделано в 1858 г |
 |
Молекулярно-генетическое исследование гена лейцинбогатой киназы 2... Молекулярно-генетическое исследование гена лейцинбогатой киназы 2 (lrrk2) у лиц с болезнью паркинсона |
|
Β-пропеллерная фитаза b acillus ginsengihumi: клонирование гена,... Пропеллерная фитаза bacillus ginsengihumi: клонирование гена, очистка белка, свойства фермента |
|
Инструкция по обновлению компонента электронной подписи. Внимание!... Внимание! Перед установкой или удалением компонента WebClientSignerSetup браузер Internet Explorer должен быть закрыт!!! |
|
Вихрева Полина Анализ гена als2CR3/grif1 человека, кодирующего возможный раковый антиген mo-ren-46 |
|
Сергей Львович Киселев, д б. н., проф., зав лаб молекулярной генетики... |
|
Мария Дорош Болезни овец и коз Купить книгу "Болезни овец и коз" у автора Дорош Мария Введение Внутренние причины развития болезни – наследственные качества и конституциональные особенности животных, приводящие к развитию уродств... |
|
Инструкция по криоконсервированию клеток крови введение для долгосрочного... Эти методы позволяют длительно (годами) сохранять клетки в жизнеспособном и функционально полноценном состоянии и после размораживания... |
|
Техническое задание на оказываемые услуги по уборке помещений Холлы,... Холлы, коридоры, фойе, тамбуры общей площадью 4158,3 м², лестничные клетки площадью 537,7 м² |
|
Биотехнология. Возникновение геномики как научной дисциплины стало возможным после Существенность гена у патогенного организма – кодируемый геном продукт необходим для |
|
1. Если атомы растворимого компонента в замещают в узлах решетки... Диаграмма состояния сплавов, образующих с ограниченной растворимостью в твердом состоянии с перитектикой, изображена на рис |
|
Народные игры в образовательном процессе дошкольных образовательных учреждений Во-вторых, потому, что русские народные подвижные игры удивительное и гармоничное сочетание устного народного творчества с заключенным... |
|
Сегментация томографических изображений грудной клетки человека для... Сегментация томографических изображений грудной клетки человека для автоматизированного выделения и визуализации тромбов |
|
Руководство по продукту Содержание Введение 3 Установка модуля «1с-битрикс: Модуль карт» Руководство предназначено для пользователей модуля «1с-битрикс: Модуль карт». В документе рассматриваются процедуры установки модуля,... |
|
Регламент определения стоимости работ (Приложение №1 к Форме №4) Оао «Славнефть-янос» приглашает Вас сделать предложение (оферту) на выполнение работ по капитальному ремонту технологических установок:... |
|
Инновационный менеджмент это управление научной, научно-технической,... Инновационный менеджмент — это система управления инновациями, инновационным процессом и отношениями, возникающими в процессе движения... |