Энзимология
|
Скачать 0.9 Mb.
|
|
Раздел 3. Регуляция активности и компартментализация ферментов РАБОТА 3.1. Оценка активности мембраносвязанной и цитозольной форм глутатионпероксидазы (4 ч.). Глутатионпероксидаза (GSH:Н2О2 – оксидоредуктаза КФ 1.11.1.9, GPО) – важнейший фермент антиоксидантной системы, использующий восстановленный глутатион для летоксикации пероксида водорода и липопероксидов, образующихся в мембранных фосфолипидах при окислительном стрессе. Фермент эритроцитов человека содержит 4 субъединицы с молекулярной массой 23 кДа каждая. В отличие от всех известных пероксидаз, GPО не содержит гема, а в активном центре фермента находятся 4 ковалентно связанных атома Se в форме селеноцистеина. GPО катализирует реакцию окисления глутатиона с образованием его конъюгированной формы. “Селензависимая” GPО обладает повышенной специфичностью к глутатиону и неспецифична по отношению к перекисям, разлагая как перекись водорода: 2GSH + H2O2 GSSG + 2H2O, так и органические гидроперекиси, в том числе и ненасыщенных жирных кислот, нуклеиновых кислот, стероидов: 2GSH + ROOH GSSG + ROH + H2O. GPО разрушает пероксид водорода с высокой скоростью. При концентрации перекиси и глутатиона, которые находятся в эритроцитах, вклад GPО в процесс удаления H2O2 оказывается большим, чем у каталазы. GPО скорее предупреждает образование перекисей в мембране за счет ингибирования этапа инициации ПОЛ (например, за счет H2O2), а не исключает продолжение (разветвление) цепи ПОЛ. Это свидетельствует в пользу превалирующей роли GPО в метаболизировании H2O2 при физиологических условиях. Компартментализацию глутатионпероксидазы изучали, используя высокодифференцированные, специализированные клетки крови – эритроциты. Выбор эритроцитов обусловлен упрощенной организацией зрелых эритроцитов – в них отсутствуют внутриклеточные органеллы, поэтому из эритроцитов легко выделить плазматическую мембрану и цитоплазму. Для выполнения работы необходимо отработать методику определения активности глутатионпероксидазы, а также методику выделения мембранного препарата из эритроцитов кроликов. Определение активности глутатионпероксидазы Принцип метода: глутатионпероксидаза (GPО) катализирует реакцию взаимодействия глутатиона (GSH) с гидроперекисью трет-бутила (ГПТБ):  Активность фермента оценивается по изменению содержания GSH в пробах до, и после инкубации с модельным субстратом в ходе цветной реакции с ДТНБК (Медицинские лабораторные технологии…, 1999). Реактивы: 1. 0,1 М трис-HCl буфер с 0,01%-ным содержанием ЭДТА рН=8,5; 2. Сложный буфер (78 мг азида натрия, 100 мг восстановленного глутатиона растворяют в 100 мл 0,1 М трис-HCl буфера с 0,01%-ным содержанием ЭДТА рН=8,5) готовится новый реактив перед каждым определением; 3. 0,14%-ный раствор ГПТБ (коммерческий препарат). Готовится новый реактив перед каждым определением; 4. 20%-ный раствор ТХУ; 5. Абсолютный метанол; 6. 0,4%-ный раствор ДТНБК, разведенный на абсолютном метаноле. Ход определения: Отмытые и упакованные эритроциты гемолизируют охлаждённой до 0ºС водой в соотношении 1:200. 0,2 мл гемолизата смешивают с 0,73 мл сложного буфера и термостатируют 10 мин при 37°С. Реакцию инициируют внесением в реакционную смесь 0,07 мл раствора ГПТБ. Строго по секундомеру, через 5 мин инкубации при 37°С, реакцию останавливают добавлением 0,2 мл раствора ТХУ. В контрольные пробы раствор ГПТБ вносят после осаждения белка ТХУ. Полученные пробы центрифугируют при 1700g в течение 10 мин. Супернатант используют для определения количества восстановленного глутатиона. Для этого к 0,1 мл супернатанта добавляют 2,65 мл 0,1 М трис-HCl буфера и 0,025 мл раствора ДТНБК. После перемешивания пробы фотометрируют на спектрофотометре, при длине волны 412 нм, в кювете с длиной оптического пути 1,0 см против дистиллированной Н2О (опытную пробу против контрольной – холостой). Активность фермента в эритроцитах выражают в мкмолях GSH, окисленного за 1 мин на грамм Hb, используя коэффициент молярной экстинкции (13600 М-1см-1) окрашенного аниона, образующегося при взаимодействии ГSH с ДТНБК. Выделение мембранного препарата эритроцитов (метод Лутра и Кима) Принцип метода: В основе выделения мембранных препаратов эритроцитов по методу Лутра и Кима лежит мягкий способ гемолиза эритроцитов, позволяющий сохранить структуру мембраны красных клеток крови (Авраамова Т.В., Титова Н.М, 1978). Реактивы: 1. 233 мМ имидазольный буфер, рН 7,4; 2. 40 мМ гистидин–имидазольный буфер, рН 7,1; 3. 160 мМ раствор NaCl. Ход работы: Для выделения мембранных препаратов используют 1 мл отмытых от плазмы и упакованных эритроцитов. Для этого 2-3 мл крови центрифугируют в течение 20 мин при 1700g (4°С). Осторожно убирают плазму и лейкоцитарный слой, расположенный на поверхности эритроцитов. Эритроциты отмывают десятикратным объемом 160 мМ раствора NаС1 и центрифугируют 20 мин при 1700g (4°С). После удаления супернатанта эритроциты гемолизируют пятнадцатикратным объемом 233 мМ имидазольного буфера, рН 7,4, предварительно охлажденного до 0°С. После тщательного перемешивания строму осаждают 20-минутным центрифугированием при 20000g (4°С). Процедуру отмывания повторяют 3 раза. Последнее отмывание проводится 40 мМ гистидин-имидазольным буфером, рН 7,1. После отмывания мембраны имеют вид пушистого белого облака. При выполнении данной работы готовят из упакованных эритроцитов мембранный препарат и гемолизат, освобожденный от обломков мембраны путем центрифугирования при 10000 g в течение 30 мин (40 С). В мембранном препарате и гемолизате определяют содержание белка и активность глутатионпероксидазы. Анализируют полученные данные и делают соответствующие выводы. РАБОТА 3.2. Аллостерическая регуляция активности глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы (4 ч.) Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназ (Г6ФД) является ферментом гексозомонофосфатного шунта. Реакция практически необратима, и соотношение субстратов и продуктов реакции в тканях указывает на то, что эта реакция весьма далека от равновесия. Высокое сродство фермента к глюкозо-6-фосфату создаёт определенные преимущества для этого фермента по сравнению с гликолитическими ферментами при конкуренции за общий субстрат. Другим важным фактором регуляции скорости этой реакции является концентрация NADP+ в клетке, зависящая от скорости окисления восстановленной формы NADPH в различных биосинтетических процессах. Восстановленная форма кофермента ингибирует дегидрогеназу глюкозо-6-фосфата. Своеобразная кинетика ингибирования реакции NADPH указывает на то, что восстановленный кофермент является аллостерическим эффектором. При изучении свойств дегидрогеназы глюкозо-6-фосфата эритроцитов было обнаружено несколько генетических вариантов изозимов этого фермента. Эти варианты дегидрогеназы различаются наличием в первичной структуре фермента аспарагина или аспарагиновой кислоты. Высокоочищенный препарат фермента из эритроцитов является тетрамером с молекулярным массой 210 кДа. Диссоциация тетрамера приводит к образованию димера (молекулярная масса 150 кДа) и малоактивного мономера (молекулярная масса 53 кДа). Тетрамер содержит две молекулы NADP+, способного к восстановлению; удаление кофактора способствует диссоциации фермента в сторону мономера с низкой активностью. Принцип метода определения активности Г6ФД основан на измерении скорости восстановления NADP+. Увеличение концентрации NADPH в ходе реакции регистрируют на фотоэлектроколориметре (КФК-3) или спектрофотометре при длине волны 340 нм (Beutler E., 1990). Источником фермента служит осмотический гемолизат, который готовят добавлением к одному объему отмытых от плазмы и упакованных эритроцитов 19 объемов дистиллированной воды, охлажденной до 0С. В связи с тем, что образующейся в ходе Г6ФД-ной реакции продукт – 6-фосфоглюконат окисляется в дальнейшем в 6-фосфо-глюконатдегидрогеназной реакции, на один моль превращенного глюкозо-6-фосфата образуется более чем один моль NADPH. Чтобы получить истинную активность Г6ФД, необходимо учесть вклад 6-фосфоглюконатдегидрогеназной реакции в образование восстановленного NADP. Для этого используют систему из четырех кювет, в которые вносят компоненты реакционной среды по следующей схеме (табл.3.2.1). Таблица 3.2.1. Состав реакционной среды для определения активности Г6ФД
Запуск реакции осуществляют путем прибавления к реакционной смеси субстрата – глюкозо-6-фосфата (Г6Ф). Измерение проводят в кварцевых кюветах с длиной светового пути 1см. Объем измеряемой пробы – 3мл. Изменения оптической плотности регистрируют через минутные интервалы в течение трех минут. Полученные значения оптической плотности используют для вычисления активности Г6ФД. Расчет активности фермента проводили по формуле:  ,где A активность глюкозо–6–фосфатдегидрогеназы; E/мин изменение оптической плотности в мин; K коэффициент, учитывающий разведение эритроцитов в реакционной пробе, равный 1000; 6.22 коэффициент экстинкции для NADPH в см2 /ммоль при длине волны 340 нм; d расстояние между рабочими гранями кюветы, см; Hb – cодержание гемоглобина в г/л. Активность Г6ФД выражают в мкмолях NADPH, образованного за одну минуту на один грамм гемоглобина. Для анализа аллостерических свойств Г6ФД определяли следующие показатели: v – начальную скорость реакции (мкмоль NADPН/мин*гHb); Vmax максимальную скорость реакции (мкмоль NADPН/мин*гHb); Км константу Михаэлиса, равную концентрации субстрата, при которой скорость реакции равна ½ Vmax (мкМ); h – коэффициент Хилла. Исследование зависимости Г6ФД-ной реакции от концентрации глюкозо-6-фосфата проводили при фиксированной концентрации NADP+ – 200 мкМ и варьируемых концентрациях субстрата – 25, 50, 100, 200, 400 и 600 мкМ. Изучение зависимости скорости реакции от концентрации NADP+ проводили при фиксированной концентрации глюкозо-6-фосфата, равной 600 мкМ и варьируемых концентрациях NADP+ – 5, 10, 20, 40, 60, 80 и 100 мкМ. Км и максимальную скорость для G6Ф определяли графически методом Хайнса-Вульфа (координаты [S]/v от [S]). [S]0,5 и максимальную скорость для NADP+ расcчитывали графически в координатах Лайнуивера-Берка с учетом коэффициента Хилла. Для оценки наличия кооперативных взаимодействий в молекуле фермента определяли коэффициент Хилла (h). Коэффициент Хилла является параметром уравнения:   , где[S]0 начальная концентрация субстрата; [S]0,5 концентрация субстрата, при которой скорость равна ½ Vmax, для аллостерических ферментов. Величину коэффициента Хилла определяли по методу, предложенному Силоновой с соавторами (Курганов Б.И., 1978). Для нахождения h строили кривую зависимости 1/V от lg[S]0, на которой выбирали три точки с координатами {1/V ; lg[S0]}, {1/V; lg[S]0}, {1/V ; lg[S]}. Значения [S0]0 для крайних точек отличаются от значения [S]0 для средней точки на постоянный множитель  и  , где > 1.Коэффициент Хилла рассчитывали по формуле:  Исследование влияния ингибитора – NADPH – на кинетику Г6ФД-ной реакции проводили при фиксированной концентрации глюкозо-6-фосфата, равной 600 мкМ, варьируемых концентрациях NADP+ – 5, 10, 20, 40, 60, 80 мкМ и трех концентрациях NADPH – 25, 50 и 100 мкМ. Изучение влияния АТР на активность и кинетические свойства Г6ФД проводили при варьируемых концентрациях глюкозо-6-фосфата – 25, 50, 100, 200, 400, 600 мкМ, фиксированной концентрации NADP+ – 200 мкМ и трех концентрациях АТР – 2,5, 5 и 10 мМ. Для расчета константы ингибирования (Ki) использовали метод Диксона (зависимость 1/v от [NADPH]) (Диксон М., Уэбб Э.,1982). РАБОТА 3.3. Денситометрический метод выявления локализации сукцинатдегидрогеназы в лимфоцитах Сукцинатдегидрогеназа (СДГ) катализирует дегидрирование янтарной кислоты с образованием фумаровой кислоты. СДГ выявляется во всех видах лейкоцитов и бластных элементах костного мозга. Для оценки активности и локализации СДГ применяется метод компьютерной морфоденситометрии. Этот метод основан на цифровой обработке изображений, что позволяет объективизировать исследования. Объект исследования характеризуется оптическими геометрическими признаками. В результате исследования в качестве выходных данных получают морфоденситометрические параметры. Мазок крови прокрашиваем на СДГ. Для этого готовим реакционную смесь: в 100 мл 0,1 М К+,Na+-фосфатном буфере с рН 7,2 помещаем 240 мг нитросинего тетразолия и 0,5 М сукцинат. Мазки фиксируем в парах формалина, затем на 30 минут помещаем в реакционную смесь при температуре 370 С. После инкубации мазки высушиваем на воздухе. Для проведения измерений сначала вводится изображение, то есть осуществляется вывод исходного изображения с телевизионной камеры, соединенной с микроскопом, на монитор (рис. 3.3.1).  Рисунок 3.3.1. Введенное с телевизионной камеры изображение цитохимически прокрашенного на сукцинатдегидрогеназу лимфоцита (Компьютерное изображение. Увеличение микроскопа об. ´ 100, оп. ´ 2,5. Программное увеличение в 14 раз) При этом получается оцифрованное исходное изображение анализируемого препарата – массив чисел, полученный по яркости исходного изображения. Изображение представляется в ЭВМ в виде первичной матрицы распределения интенсивностей. Матрица имеет размерность 256´256 элементов (пиксель). Каждый элемент матрицы представляет собой усредненную на площади 1 пиксель величину интенсивности. При этом интенсивность каждого ее элемента лежит в пределах от 0 до 255, т.е. всего 256 градаций полутонов серого при квантовании по интенсивности от 0 - черное до 255 - белое (байт на точку). Из введенного фрагмента препарата выделяется интересующий объект, то есть лимфоцит с черными гранулами формазана. В результате последовательного повторения этой операции составляется видеоархив препарата (рис. 3.3.2).  Рисунок 3.3.2 – Видеоархивы: А – лимфоциты со слабой реакцией на сукцинатдегидрогеназу; Б – лимфоциты с выраженной реакцией на сукцинатдегидрогеназу (Компьютерное изображение. Увеличение микроскопа об. ´ 100, оп. ´ 2,5. Программное увеличение в 8 раз). Затем проводятся операции, в результате которых одно изображение преобразуется в другое. Возможно преобразование полутонового изображения в оверлейное (бинарное). Оверлейное изображение имеет такую же пространственную размерность, как и само изображение – 256´256, но каждый элемент оверлея может принимать только два значения - 0 или 1 (бит на точку). На следующем этапе изображение подвергается процессу обработки. К наиболее важным операциям преобразования изображения относятся оцифровывание, кодирование и сжатие данных, улучшение качества и восстановление, сегментация, анализ изображений. Для улучшения качества изображения проводится цифровая фильтрация изображения (включает свыше 20-ти стандартных фильтров) и редактирование изображения. Результаты некоторых операций представлены на рис. 3.3.3. Далее проводятся измерения заданных параметров. Полученные количественные данные сохраняются в файле. После этого на экран дисплея компьютера выводятся данные, содержащие результаты измерения данного объекта. Таким образом, ферментативная реакция оценивается количественно. С помощью камеры Горяева производят пересчет количественных параметров геометрическим величинам. Измерено, что при стандартно используемых характеристиках микроскопа (объектив 100, оптовар 2,5) 1 мм=13110 пиксель и 1 мм2=171872100 пиксель2. Р  исунок 3.3.3. Последовательный компьютерный анализ активности (по цитохимическому препарату) сукцинатдегидрогеназы лимфоцитов крови здорового человека (Компьютерное изображение. Увеличение микроскопа об. ´ 100, оп. ´ 2,5. Программное увеличение в 28 раз). Исходя из этого, морфологические параметры представлены в метрических величинах (табл. 3.3.1). Значение интегральной оптической плотности вычисляется программой “Cito”, вследствие чего данный показатель не переводится в метрическую величину. Таблица 3.3.1. Измеряемые морфоденситометрические параметры активности ферментов
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||