Энзимология

Скачать 0.9 Mb.

Название	Энзимология
страница	3/7
Тип	Учебно-методическое пособие

rykovodstvo.ru > Руководство эксплуатация > Учебно-методическое пособие

1 2 3 4 5 6 7

Раздел 2. Ферментативный катализ
РАБОТА 2.1. Природа субстрата и активность глутатион-S-трансферазы (2 ч.)

Глутатион-S-трансфераза (К.Ф. 2.5.1.18 донор: восстановленный глутатионтрансфераза, ГST) входит в семейство ферментов, нейтрализующих токсическое влияние различных гидрофобных и электрофильных соединений путем их конъюгации с восстановленным глутатионом. Все ГSТ – гомо – или гетеродимеры с молекулярной массой 57 кДа. ГSТ обезвреживает органические соединения почти всех классов: алкены, арены, аралкены, производные серы, лаки, краски, пестициды, канцерогены, такие как азокрасители, бенз(а)пирен и метилхолантрен, и т.д.

Глутатион-S-трансферазы проявляют строгую специфичность в отношении восстановленного глутатиона и широкую специфичность для второго субстрата. Эритроциты содержат две изоформы фермента, отличающиеся субстратной специфичностью, физико-химическими, кинетическими, структурными и иммунологическими свойствами: анионную и катионную ГST.

Принцип метода. Активность глутатион-S-трансферазы определяют по скорости образования глутатион-S-конъюгатов между восстановленным глутатионом и 1-хлор-2,4-динитробезолом (ХДНБ):
ХДНБ + глутатион - SH → ХДНБ - S- глутатион
Увеличение концентрации конъюгатов в ходе реакции регистрируют спектрофотометрически при длине волны 340 нм (максимум поглощения глутатион -S-ХДНБ).

Исследуемый материал: эритроциты лабораторных животных (кролик, крыса);

Реактивы:

1. 0,1 М. калий-фосфатный буфер, рН 6,5.

2. 0,015 М раствор ГSН.

3. 0,015М раствор 1-хлор-2,4-динитробензола, куменггидропероксида, третбутил гидропероксида, приготовленные на метаноле.

Оборудование: пробирки, пипетки, рефрижераторная центрифуга, спектрофотометр, иономер.

Ход работы:

Источником фермента служит осмотический гемолизат, который готовят добавлением к одному объему отмытых от плазмы и упакованных эритроцитов двадцати объемов дистиллированной воды охлажденной до 0С. В кювету спектрофотометра последовательно вносят 2,5 мл 0,1 М калий-фосфатного буфера рН=6,5, 0,2 мл 0,015 М раствора восстановленного глутатиона и 0,1 мл гемолизата.

Реакцию инициируют внесением в кювету 0,2 мл соответствующего субстрата. Параллельно опытной, готовят контрольную пробу, в которую вместо биологического материала вносят дистиллированную воду. Регистрацию оптической плотности проводят при t=25C и длине волны 340 нм против воды сразу после перемешивания в течение трех минут. Полученные значения оптической плотности используют при вычислении активности ГSТ.

Активность фермента рассчитывают, используя коэффициент молярной экстинции для ГS-ХДНБ при длине волны 340 нм, равный 9,6 мМ^-1см^-1, и выражают в ммоль образующихся глутатион S-конъюгатов в минуту на грамм гемоглобина.

, где
А – активность фермента, ммоль/минг Hb;

Е – изменение оптической плотности в минуту;

d – толщина слоя кюветы (1 см);

 – коэффициент молярной экстинкции ГS-HDNB при длине волны 340 нм (9600 М

см

);

f – коэффициент разведения эритроцитов в пробе (630).

t – время наблюдения, мин;
В работе анализируется активность глутатион-S-трансферазы при использовании в качестве субстрата трех веществ: 1-хлор-2,4-динитробезолом (наиболее часто используемым для определения активности ГSТ), кумен гидропероксида и трет-бутил гидропероксида.
РАБОТА 2.2. Специфичность действия малатдегидрогеназы (2 ч.)
Малатдегидрогеназа (L-малат: NAD⁺ оксидоредктаза, КФ 1.1.1.37, МДГ) катализирует обратимую реакцию окисления яблочной кислоты до щавелевоуксусной. Фермент локализован как в цитоплазматической, так и в митохондириальной фракции клеток. Митохондриальная NAD-МДГ имеет молекулярную массу 62-65 кДА, состоит из двух субъединиц. Фермент катализирует один из этапов цикла лимонной кислоты и поставляет NADH в дыхательную цепь митохондрий.

Принцип метода. Определение активности малатдегидрогеназы в суспензии митохондрий проводят, используя прямую малатдегидрогеназную реакцию, в которой количество окисленного малата эквимолярно количеству восстановленного NADH в ходе реакции, регистрируемой спектрофотометрически при длине волны 340 нм.

В работе используются коммерческие препараты малатдегидрогеназы и различные субстраты (L-малат, оксалоацетат и β-гидроксибутират) для проведения малатдегидрогеназной реакции.
Окисление отдельных субстратов
Зависимость скорости окисления субстрата от его концентрации для трех разных субстратов изучают следующим образом:

1). Окисление малата. В 4-см спектрофотометрическую кювету вносят 4 мл 0,3 М глицинового буфера, рН 10, и 0,4 мл 50 мМ раствора NAD⁺. Затем в кювету добавляли различные объемы 5 мМ раствора L-малата натрия (указаны в таблице) и общий объем пробы доводят водой до 11,9 мл. Реакцию начинают добавлением 0,1 мл разбавленного в 10 раз экстракта сердечной мышцы и измеряют оптическую плотность при 340 нм через каждые 30 с в течение 3 мин. Полученные данные заносят в таблицу 2.2 .1.
Таблица 2.2.1. Окисление L-малата малатдегидрогеназой

Время, мин	Оптическая плотность при 340 нм
	Объем добавленного 5 мМ раствора L-малата, мл
	2,4	1,2	0,72	0,48	0,24	0,12
0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0	0,085 0,162 0,236 0,310 0,385 0,458	0,060 0,123 0,184 0,245 0,395 9,367	0,070 0,120 9,169 0,220 0,269 0,319	0,048 0,086 0,123 0,160 0,199 0,236	0,027 0,051 0,074 0,099 0,122 0,145	0,019 0,033 0,046 0,061 0,074 0,087

2). Окисление мезотартрата. Условия опыта для изучения окисления мезотартрата такие же, как и в случае малата, но вследствие того, что скорость реакции в этом случае будет значительно меньше, используют большие количества экстракта. Все добавки такие же, как и при изучении окисления малата, за следующими исключениями: 1) изменены концентрации субстрата (указаны в таблице) и 2) объем пробы доводили водой до 11,5 мл и реакцию начинали добавлением 0,5 мл неразбавленного экстракта. Полученные данные заносили в таблицу 2.2.2.
Таблица 2.2.2. Окисление мезотартрата малатдегидрогеназой

Время, мин	Оптическая плотность при 340 нм
	Объем добавленного 10 мМ раствора мезотартрата, мл
	2,4	1,2	0,6	0,36	0,28	0,18
0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0	0,034 0,068 0,100 0,133 0,166 0,198	0,029 0,054 0,078 0,102 0,127 9,152	0,024 0,040 9,057 0,073 0,090 0,106	0,012 0,023 0,035 0,046 0,056 0,067	0,008 0,018 0,027 0,036 0,045 0,055	0,008 0,015 0,022 0,028 0,035 0,042

3). Окисление DL-α-оксибутирата. Этот субстрат окисляется со скоростью, промежуточной между скоростями окисления малата и мезотартрата. Поэтому при измерении скорости реакции берут разные объемы субстрата (указаны в таблице), конечный объем пробы доводят водой до 11,9 мл и реакцию начинают добавлением 0,1 мл неразбавленного экстракта. Полученные данные заносят в табл. 2.2.3.
Таблица 2.2.3. Окисление DL-α-оксибутирата малатдегидрогеназой

Время, мин	Оптическая плотность при 340 нм
	Объем добавленного 50 мМ раствора оксибутирата, мл
	2,4	1,2	0,72	0,48	0,36	0,24
0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0	0,068 0,117 0,164 0,213 0,259 0,307	0,055 0,094 0,130 0,170 0,208 9,244	0,040 0,069 9,098 0,127 0,156 0,184	0,030 0,054 0,077 0,101 0,125 0,148	0,021 0,040 0,060 0,079 0,099 0,119	0,019 0,034 0,048 0,063 0,078 0,093

Окисление смеси субстратов
Поскольку возможно, что окисление двух или даже всех трех субстратов катализируется одним ферментом, изучают окисление смеси субстратов. В опытах используют ту же реакционную смесь, что и выше. Объемы добавленных субстратов приведены в табл. 2.2.4.
Таблица 2.2.4. Состав смеси субстратов для определения малатдегидрогеназы

Добавленные субстраты	номер кюветы
Добавленные субстраты	1	2	3	4
5 мМ L-малат, мл	0,24	0,48	0,24	0,48
10 мМ мезотартрат, мл	2,4	1,2	-	-
50 мМ α-оксибутират, мл	-	-	2,4	1,2

Объём пробы доводят водой до 11,9 мл и в каждом случае реакцию начинают добавлением разбавленного в 10 раз экстракта. Результаты опытов заносят в табл. 2.2.5.
Таблица 2.2.5. Окисление смеси субстратов малатдегидрогеназой

Время, мин	Оптическая плотность при 340 нм
	номер кюветы
	1	2	3	4
0,5	0,014	0,033	0,048	0,061
1	0,924	0,056	0,075	0,101
1,5	0,033	0,079	0,103	0,142
2	0,042	0,102	0,130	0,183
2,5	0,052	0,125	0,158	0,223
3	0,061	0,148	0,184	0,263

Примечания

1. Структура использованных субстратов следующая:

2. Молярный коэффициент поглощения восстановленного NAD при 340 нм равен 6220.

3. Одним из способов смещения равновесия дегидрогеназной реакции в сторону более полного окисления субстрата является использование агентов, связывающих кетоны. Другим, часто более удобным методом, может быть увеличение рН реакционной смеси. Так как при большинстве значений рН окисленная форма NAD имеет один отрицательный заряд, а восстановленная форма – два, реакцию можно представить в следующем виде:
RCHOHR' + NAD^- → RCOR' + NADН + Н⁺
При увеличении рН среды концентрация одного из продуктов реакции (Н⁺) становится очень низкой, и, таким образом, равновесие смещается вправо. Именно этот метод был использован в описанных выше опытах. Хотя NAD сам по себе неустойчив в течение долгого времени при рН 10, а дегидрогеназы также теряют свою активность при столь высоких значениях рН, оба эти явления можно не принимать во внимание, так как определение активности ферментов проводилось в течение достаточно короткого промежутка времени.

4. При спектрофотометрических измерениях часто для увеличения чувствительности оказывается весьма удобным пользоваться кюветами с большой оптической длиной, так как увеличение оптической длины кюветы приводит к соответствующему увеличению оптической плотности, измеряемой в опыте.

По результатам эксперимента строят графики зависимости скорости реакции от различных концентраций исследуемых субстратов. Затем используют один из способов линеаризации гиперболической зависимости (метод Лайнуивера-Берка, Хайнса, Иди-Хофсти, Эйзенталя и Корниш-Боудена). Проводят кинетическую обработку экспериментально полученных данных: определение констант Михаэлиса и максимальной скорости реакции проводится для каждого субстрата. На основании полученных данных сделать выводы относительно субстратной специфичности малатдегидрогеназы по отношению к различным субстратам. Ответить на вопрос: какое число дегидрогеназ участвует в окислении смеси субстратов?

1 2 3 4 5 6 7

Руководство, инструкция по применению