 ПРАВИТЕЛЬСТВО РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ
УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ
«САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»
(СПбГУ)
Институт наук о Земле
Храпова Екатерина Петровна
Сохранность хлорофиллоподобных соединений в мицеллах гуминовых веществ
Выпускная квалификационная работа бакалавра
по направлению 021900 «Почвоведение»
«К ЗАЩИТЕ»
Научный руководитель:
д.с.-х.н., проф. А.И. Попов
____________________
«___»___________
Заведующий кафедрой:
д.с.–х.н., проф. Б. Ф. Апарин
____________________
«___»___________ 2016
Санкт – Петербург
2016
Содержание
Введение
Почва – самостоятельным естественно–историческое тело, которое является продуктом совокупной деятельности материнской горной породы, климата, растительных и животных организмов, возраста почвы и рельефа местности [16]. Согласно концепции «почва–память» почва способна сохранять в своих устойчивых твердофазных свойствах информацию об условиях своего формирования [19]. «Расшифровка» этой информации является одной из основных задач современного генетического почвоведения. Однако, вследствие влияния множества факторов, трактовка генезиса почвы представляет из себя комплексную задачу.
В связи с этим, важной задачей становится поиск соединений–индикаторов, которые, наглядно и однозначно отражают направленность протекания элементарных почвообразовательных процессов, длительное время сохраняются в почве, а также легко поддаются лабораторному изучению. Такими веществами являются хлорофиллоподобные соединения (ХПС) и другие родственные им пигменты порфириновой природы. Анализ содержания ХПС используется в палеопочвоведении для оценки сохранности органического вещества и биологической активности [15], а также в современных почвах, как индикатор переувлажнения [20]. Эти вещества легко определяются в почвах даже при незначительном их содержании спектрофотометрическим методом, учитывая, что большинство тетрапиррольных соединений в ацетоновых и спиртовых растворах имеет отчётливый максимум поглощения при λ = 660 – 670 нм.
Известно, что ХПС в погребённых почвах способны сохраняться до нескольких тысяч лет [11; 14]. В то же время рядом авторов было установлено, что хлорофилл, искусственно внесённый в почву, при нормальных условиях разлагается в течение 30 – 50 дней [2; 5]. Таким образом, механизм сохранения ХПС в почвах является дискуссионным.
Возможно, протекция ХПС обеспечивается солюбилизирующими свойствами ГВ. Солюбилизация – самопроизвольный и обратимый процесс внедрения лиофобных соединений в мицеллы поверхностно–активных веществ (ПАВ). Анализ литературных данных показал, что ГВ, как мицеллярные структуры, обладают солюбилизирующей способностью по отношению к некоторым органическим веществам (например, кубовым красителям, биоцидам, минеральному маслу) [27], [30], [35].
В рамках данной работы была выдвинута гипотеза, что хлорофилл способен сохраняться в почвах не только вследствие низкой биологической активности, но и благодаря специфическим протекторным свойствам мицелл гуминовых веществ (ГВ).
Таким образом, целью исследования было выявление вероятностного механизма сохранения хлорофиллоподобных соединений (ХПС) в мицеллах гуминовых веществ (ГВ).
Для достижения этой цели, были поставлены следующие задачи:
1. Подтвердить возможность солюбилизации ХПС мицеллами ГВ;
2. Доказать протекторную функцию мицелл ГВ по отношению к ХПС;
3. Рассмотреть изменение протекторных свойств ГВ в зависимости от: концентрации ГВ, изменения pH среды, модификации мицелл ГВ различными катионами (Ca2+, Al3+ и Fe3+).
По результатам работы были опубликованы статьи:
1) Попов А. И., Панина Е. П., Верлова Т. А., Солдатова Л. А., Храпова Е. П. Свойства гуминовых веществ, как коллоидных дисперсий (обзор литературы) // Вестник Российской академии естественных наук. 2014. № 5. С. 39 – 45.
2) Храпова Е., Солдатова Л., Калашников М., Попов А.И. Солюбилизация порфириновых соединений структурированными мицеллами гуминовых веществ // Сб. тезисов / Третья междунар. конф. СНГ МГО по гуминовым инновационным технологиям / Десятая Междунар. конф. daRostim «Гуминовые вещества и другие биологически активные соединения в сельском хозяйстве» / HIT – daRostim – 2014 / 19 – 23 ноября, 2014, МГУ им. М. В. Ломоносова, Москва, Россия / Под ред. И. В. Перминовой, Н. А. Куликовой и О. С. Якименко. – М., 2014. c. 182.
1. Обзор современных достижений науки в данной области, связанной с изучением хлорофиллоподобных соединений в почве.
Хлорофиллоподобные соединения относятся к неспецифическим органическим соединениям, и извлекаются в составе липидной фракции гумуса [24]. Кроме хлорофиллов к ХПС относят другие родственные пигменты и продукты их деструкции, в состав которых входит порфириновое кольцо [25]. Содержание хлорофилла в почве варьируется от 0,03 до 4мкг на грамм почвы [34].
Хлорофиллоподобные соединения активно используются в палеопочвоведении как показатели биологической активности [25] и как индикаторы сохранности органического вещества [15] вследствие того, что они имеют ограниченное число путей попадания в осадок (только из растительных остатков), легко анализируются в лабораторных условиях, могут быть обнаружены даже в незначительных количествах и неустойчивы в биологически активной среде [14]. Также анализ содержания ХПС используют для индикации переувлажнения почв благодаря чувствительности этого показателя к водно – воздушным условиям и динамичности его изменения [18, 19].
Существует несколько методов изучения ХПС в почве. Впервые хлорофилл в почве был качественно идентифицирован Торстенссоном по флюоресценции вытяжки из торфяной почвы [9]. Количественные методы определения ХПС просты в исполнении и не требуют наличия дорогостоящего оборудования. Почвенный хлорофилл извлекается либо экстракцией этиловым спиртом с бензолом (1:1) при анализе липидной фракции почвенного гумуса [32], либо по методике, впервые описанной П. Хойтом, при помощи 90% ацетона [5]. В вытяжке ХПС определяют спектрофотометрически при длинах волн λ = 660 – 670 нм.
Однако, как было показано Ф.Н. Козыревым, спектрофотометрирование можно заменить колориметрированием с узкополосным светофильтром [19]. Кроме ХПС в ацетоновой вытяжке также могут быть определены каротиноиды.
Как было сказано выше, ХПС активно используется в палеодиагностике почв. Время сохранения ХПС в почвах варьируется у разных авторов от 4 000 до 11 000 [11], [17]. Однако, при условиях крайней изолированности от биологически активной среды (например, в глинистых отложениях), ХПС могут сохраняться десятки миллионов лет [25].
При этом рядом авторов относят ХПС к группе веществ, неустойчивых в почве [5], [25]. Так, Симонаром при помощи меченого углерода было установлено, что при нормальных условиях хлорофилл разлагается в течение 30 дней [2]. Сам процесс трансформации ХПС в почве остаётся не до конца изученным [25]. Д.С. Орловым был предложен следующий механизм преобразований хлорофилла в почве: «В почве под действием микроорганизмов хлорофилл быстро транс¬ формируется. Сначала он теряет магний, образуя феофитин А, а затем отщепляется фитольная боковая цепь с формированием феофорбида А. После этого осуществляется более глубокий распад при возможном включении пирролов в состав гумусовых веществ» (рисунок 1) [25].
Рисунок 1 – Преобразование хлорофилла в почве по Д.С. Орлову [25]
Валентайн предполагал, что стадии отщепления магния и фитиловой группы могут меняться местами. Тогда схема преобразования хлорофилла выглядит следующим образом [5]:
Chlorophyll a minus Mg→pheophytina minus phytyl→pheophorbide a
Chlorophyll a minus phytyl→chlorophyllide a,minus Mg→ pheophorbide a
Также существует мнение, что в почве существует пул хлорофиллов, в которых происходит замена атома магния на атом железа, через который, благодаря наличию свободной валентности, осуществляется соединение с гуминовыми веществами почвы. Хлорофилл с атомом железа было предложено выделять смесью ацетона и гидроксил амина [19].
Поступление и поведения ХПС в почве было освещено в работах П. Хойта [4], [5], [6]. Им впервые было выделено две стадии разрушения хлорофилла: первая – быстрая, происходит в клетках растений под действием энзимов, и вторая – медленная – связана с деятельностью микроорганизмов в почве [5]. Оценивая факторы, влияющие на сохранность хлорофилла в почве, Хойт отметил следующие закономерности, важные в контексте данного исследования:
1) Избыточное увлажнение наряду с глубоким иссушением являются основными факторами, обеспечивающими сохранность ХПС в почве. И, если недостаток влаги прямо влияет на биологическую активность (вторю стадию разрушения хлорофилла), то переувлажнение затрагивает как вторую, так и первую стадию т.к. энзимы растительной клетки инактивируются при погружении растительного материала в воду;
2) Неодинакова скорость разложения различных ХПС. При компостировании растительного материала и дальнейшем исследованием ХПС при помощи метода бумажной хроматографии было доказано, что самым нестойким соединением является хлорофилл а, за ним следует хлорофилл b. Дольше всего в компосте сохранялся феофетин;
3) Было показано, что сохранность ХПС зависит от pH почвы. После 42 дней инкубации в почве при ph>6,8 сохранялось в среднем только 8% от исходного содержания ХПС; при рН=5 – 5,5 эта цифра достигала 38%. Самый высокий процент сохранности ХПС достигался при кислой реакции среды (рН=3,6) и составлял порядка 50%. При этом важно отметить, что в кислой среде основные потери ХПС (примерно 30%) приходились на первый день эксперимента. Возможно, это происходило вследствие кислотного гидролиза ХПС. Найденная Хойтом на модельных опытах зависимость сохранности ХПС от рН почвы подтверждается исследованиями зональных и палеопочв [14; 33].
Итак, сохранность хлорофилла всеми авторами связывалась с пониженной биологической активностью в почве вследствие ряда факторов (недостаток или избыток влаги, pH среды, физическую изоляцию вследствие погребения почвы). Отсутствуют исследования, связывающие сохранность ХПС в почвах и коллоидные (в частности, солюбилизирующие) свойства гуминовых веществ.
Гуминовые вещества (ГВ) – тёмно окрашенные природные амфифильные органические азотсодержащие рандомизованные редокс – гетерополимеры арилгликопротеидной природы, являющиеся полиамфолитами и проявляющие кислотные свойства т.е. имеют в своём составе как гидрофильные, так и гидрофобные участки [29]. ГВ – дифильные (амфифильные) коллоиды [10; 22]. По этой причине они были отнесены к поверхностно–активным веществам [1; 3; 7; 21]. Как и все поверхностно–активные вещества, молекулы ГВ способны образовывать ассоциаты – мицеллы – физически рыхлые глобулы [1].
Рисунок 2 – Строение структурированной мицеллы гуминовых веществ [29].
Глобулы ГВ, в свою очередь способны образовывать четвертичные структуры [20], [28].
Рисунок 3 – Гуминовые вещества озерного сапропеля [29].
Вследствие мицеллярного строения ГВ и наличия в мицеллах порового пространства, в ядрах мицелл ГВ может происходить солюбилизация гидрофобных органических соединений [8]. Солюбилизация – самопроизвольный и обратимый процесс внедрения лиофобных веществ в мицеллы поверхностно–активных веществ [35].
Известно, что ГВ обладают солюбилизирующей способностью по отношению к таким органически веществам, как биоциды, кубовые красители, минеральное масло [23; 27; 30].
Суммируя вышесказанное, можно отметить, что хлорофиллоподобные соединения способны длительное время сохраняться в почве в условиях пониженной биологической активности. Наиболее чувствителен к изменению микробиологических условий хлорофилл А. Сохранность ХПС напрямую зависит от рН среды.
Мицеллярное строение ГВ обуславливает их солюбилизирющие свойства, которые используются в различных химических производствах.
При анализе литературных данных, не было найдено исследований, связывающих сохранность ХПС в почвах с солюбилизирующей способностью ГВ.
2. Объекты и методы исследования
При анализе и обобщении литературных данных использовался естественноисторический подход. Содержание органического вещества в экстракте ГВ, физико–химические свойства вермикомпоста, содержание общего органического углерода, влажность, pHH2O, потери при прокаливании, определялись с помощью методик, описанных в «Руководстве по химическому анализу почв» [13] и в практическом руководстве «Физика почв» [31]. Определение частиц меньше 0,25 мм проводилось с помощью универсального лазерного дифракционного анализатора размера частиц SALD-2201 фирмы Shimadzu (Япония), комплектованного ёмкостной кюветой. Фракцию 1–0,25 мм улавливали механическим путём, используя сито с диаметром ячейки 0,25 мм и проводя дальнейшее высушивание и взвешивание. Результаты дифрактометрического определения приводили к размерности фракций по Н.А. Качинскому..
При обработке результатов была проведена оценка статистических характеристик количественной изменчивости малой выборки (ПРИЛОЖЕНИЕ А). Оценка проводилась по методическому пособию «Статистическая обработка экспериментальных данных» [12]. Все вычисления выполнены в программе Microsoft Excel.
Содержание хлорофилла а определяли фотометрическим методом, описанным в ГОСТ 17.1.4.02 – 90 [36].
Концентрат хлорофилла готовили путем экстракции из сухих листьев крапивы. Брали 5 грамм измельченных сухих листьев Urtica dioica L., добавляли 500 мл ацетона, производили холодную экстракцию в течение 2 часов. По истечении 2 часов, полученную суспензию фильтровали через фильтр синяя лента. Фильтрат помещали в темную банку с плотно закрывающейся крышкой. Результаты фотометрического определения содержания хлорофилла показали, что экстракт ХПС содержит 21 мкг/л хлорофилла А. Основной причиной выбора хлорофилла а в качестве вещества – индикатора в опытах по защите ХПС мицеллами ГВ является то, что в литературе отмечается подверженность этого вида ХПС разрушению в почвенных условиях. Это свойство хлорофилла а позволяет более точно прослеживать влияние различных факторов на защитные свойства ГВ по отношению к ХПС.
Экстракция гуминовых веществ производилась из вермикомпоста, свойства которого описаны в таблице 1.
Таблица 1. Физико–химические свойства вермикомпоста
Характеристика
|
Значение
|
потери при прокаливании при температуре 600 C, %
|
26,0
|
зольность, %
|
74,0
|
pHH2O (1:5)
|
7,1
|
сумма обменных оснований, мэкв/100 г сухого вещества
|
35,8
|
влажность, %
|
10,3
|
Общее содержание углерода (Собщ.), % на сухое вещество
|
12,35
|
Общее содержание азота (Nобщ.), % на сухое вещество
|
0,8
|
С:N
|
15,4
|
общее содержание фосфора (P2O5), % на сухое вещество
|
0,8
|
общее содержание калия (K2O), % на сухое вещество
|
0,5
|
общее содержание кальция (CaO), % на сухое вещество
|
0,5
|
общее содержание магния (MgO), % на сухое вещество
|
0,1
|
подвижные соединения фосфора (Р2О5), мг/100 г субстрата
|
358
|
подвижные соединения калия (К2О), мг/100 г субстрата
|
175
|
Гуминовые вещества выделяли нейтральным раствором пирофосфата натрия. Раствор ГВ отделяли от минеральной части фильтрованием через фильтр синяя лента. Очищенный от минеральных примесей раствор ГВ доводили серной кислотой pH до 1. Затем ГВ сорбировали на капроновой смоле, находящейся на фильтре Нутча, собрент с сорбатом промывали 0,1 н. раствором серной кислоты. Гуминовые вещества десорбировали 0,02 н. раствором NaOH. С помощью диализа через целлофановую плёнку обессоливали до отрицательной реакции на сульфат – ион. В дальнейшем раствор ГВ разбавляли дистиллированной водой, чтобы получить растворы заданной концентрации для последующих тестов. Выбранные концентрации определялись порогом агрегативной неустойчивости (ПАН). Опыты были проведены на концентрации раствора равной концентрации ПАН, концентрации в два раза меньше и два раза больше ПАН.
Порог агрегативной неустойчивости определялся следующим методом:
В раствор, которым извлекались ГВ, добавлялась концентрированная H2SO4 до pH ~ 1, температуру смеси доводили до 70-80 ºС; и в горячий раствор по каплям из бюретки приливался раствор ГВ с известной концентрацией до образования легкого осадка. Минимальное количество ГВ соответствовало величине ПАН (мг C/л).
Модификацию гуминовых веществ ионами кальция, алюминия и трехвалентного железа проводили следующим образом: катионит КУ–2 насыщали ионами железа окисного или ионами алюминия, или ионами кальция, а затем катионит добавляли к раствору гуминовых веществ. В результате образовывались структурированные коллоидные мицеллы ГВ закрепленные поливалентными ионами. Полученную таким образом суспензию помещали в стакан, взбалтывали, давали смеси отстояться. Катионит первым оседал на дно сосуда, верхнюю часть смеси с более легкими мицеллами ГВ отделяли и использовали в работе.
Оценка защитных свойств ГВ по отношению ХПС оценивали по следующей схеме:
1. Раствор ГВ заданной концентрации в количестве 10 мл смешивали с 1 мл экстракта ХПС в чашке Петри;
2. Чашку Петри с раствором в открытом виде помещали под ртутно–кварцевую лампу. Время экспозиции составляло 60 минут;
3. После обработки ультрафиолетовым излучением, содержимое чашки Петри интенсивно перемешивалось с 90 мл ацетона;
4. Полученную суспензию центрифугировали при 3000 об/мин в течение 20 минут;
5. По окончании центрифугирования, надосадочную жидкость анализировали на спектрофотометре и определяли содержание хлорофилла А;
Корректировка pH растворов ГВ производилась 0,02 н раствором гидроксида натрия и 0,02 н раствором серной кислоты. Контрольные варианты тестов, в которых экстракт ХПС заменялся на чистый ацетон, проводили для оценки уровня экстракции ГВ в ацетон. % защиты ХПС рассчитывался через отношение концентрации хлорофилла а в вариантах тестов с обработкой ультрафиолетом и раствором ГВ к концентрации хлорофилла А в вариантах теста без ГВ и облучения. В случае, если происходила экстракция ГВ в ацетон, в расчет вводили поправку – из результата содержания хлорофилла а после ультрафиолетовой обработки вычитали значение, полученное в вариантах без хлорофилла, но с ГВ, облучением ультрафиолетом и последующей экстракцией в ацетон.
|
