Методическое пособие Рекомендовано Методическим Советом по аспирантуре Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Оренбургский государственный медицинский университет»

Скачать 1.11 Mb.

Название	Методическое пособие Рекомендовано Методическим Советом по аспирантуре Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Оренбургский государственный медицинский университет»
страница	7/16
Тип	Методическое пособие

rykovodstvo.ru > Руководство эксплуатация > Методическое пособие

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 ... 16

Культивирование микроорганизмов

Питательные среды

Известно очень много питательных сред для культивирования микроорганизмов (более двух тысяч наименований было классифицировано Левином и Шенлейном еще в 1930 г.), но число ингредиентов, являющихся их неотъемлемыми компонентами, относительно невелико. Однако качественный диапазон этих сред весьма широк — от растворов неорганических солей, на которых могут расти автотрофы, до сложных питательных сред, приготавливаемых из мясных гидролизатов, обогащенных кровью или сывороткой; ими обычно пользуются для выделения патогенных микроорганизмов типа стрептококков, отличающихся высокой требовательностью к составу питательной среды. Различают два основных типа питательных сред: так называемые синтетические среды, главные составные части которых точно известны (например, глюкозо-солевая питательная среда), и эмпирически подобранные питательные среды природного происхождения, состав которых точно неизвестен (к ним относятся пептоны, приготавливаемые из частично гидролизованного белка).

Выбор питательной среды зависит в значительной степени от цели эксперимента. Герберт настойчиво высказывался за повсеместное использование синтетических питательных сред. Однако следует признать, что они обладают рядом практических неудобств. Микроорганизмы, выращенные на таких питательных средах, обычно фенотипически отличаются от выращенных на питательных средах естественного происхождения типа бульона (например, по составу и по скорости деления). Размножение микроорганизмов на таких средах обычно легче подавляется избыточной аэрацией или токсическими катионами; они также более чувствительны к нарушениям баланса между некоторыми составными частями питательной среды, особенно аминокислотами. Многие бактерии нуждаются в большом числе факторов роста, и для некоторых из них до сих пор не найдены искусственные среды, на которых они могли бы размножаться. Возможно, что все эти неудобства со временем будут преодолены, но пока среды неизвестного состава типа бульонов, приготовленных из перевара, используются весьма широко, хотя они и вносят в эксперимент неконтролируемые факторы.

В литературе опубликованы результаты количественных анализов многих питательных сред природного происхождения, что является определенным шагом на пути к их стандартизации. Однако данными этих анализов следует пользоваться с осторожностью, поскольку результаты определений, проведенных независимо друг от друга, демонстрируют существенные различия состава различных партий одной и той же питательной среды. Более того, при проведении анализов обычно игнорируется наличие в питательных средах многих существенно важных составных частей, хотя ясно, что компоненты, требуемые в следовых количествах, например витамины и катионы, могут присутствовать в исключительно малой концентрации. При этом может оказаться, что размножение бактерий идет нормально, тогда как процессы типа споруляции или адсорбции фага ингибируются.

В состав сред, применяемых для выращивания бактерий, входят необходимые для построения белков цитоплазмы элементы: азот, углерод, водород, кислород, неорганические соединения, содержащие фосфор, калий, серу, натрий, магний, железо, микроэлементы: кобальт, йод, марганец, бор, цинк, молибден, медь и др. Все перечисленные элементы должны находиться в питательной среде в удобоусвояемом для данного микроорганизма соединении, причем требования различных микробов в этом отношении неодинаковы. Потребность в кислороде и водороде бактерии удовлетворяют главным образом за счет поступающей в клетку воды.

По характеру усвоения азота патогенные микроорганизмы делятся следующим образом: одни из них извлекают азот из простых аммонийных соединений, другие нуждаются в аминокислотах, третьи расщепляют высокомолекулярные вещества — пептоны, представляющие собой продукты неполного ферментативного переваривания белков. Строго паразитические виды бактерий размножаются только в присутствии нативного, т. е. неизмененного, белка.

Источником углерода для патогенных бактерий являются, главным образом, различные углеводы: сахар, многоатомные спирты, органические кислоты и их соли.

Потребность бактерий в неорганических элементах удовлетворяется прибавляемыми к питательной среде солями: NaCI, KH₂PO₄, K₂HPO₄ и т. д. Микроэлементы, выполняющие роль катализаторов химических процессов, необходимы в ничтожно малых количествах и поступают в питательную среду с пептоном, неорганическими солями и водой.

Наряду с перечисленными органическими и неорганическими элементами бактерии нуждаются в ростовых факторах, которые по своей роли соответствуют витаминам для животных. Источником факторов роста являются прибавляемые к питательной среде продукты растительного и животного происхождения, содержащие в своем составе никотиновую, пантотеновую, парабензойную кислоты, витамины А, В, С и др.

Питательные вещества могут усваиваться микробами только при определенной реакции питательной среды, так как проницаемость оболочек микробных клеток изменяется в зависимости от рН среды.

Потребность в питательных веществах и физических условиях у различных видов микробов неодинакова и этим исключается возможность создания универсальной питательной среды.

По консистенции различают плотные и жидкие питательные среды. Плотные питательные среды готовят из жидких посредством прибавления к ним клеевых веществ - агара или желатина. Агар-агар (по малайски – желе) — продукт растительного происхождения, добываемый из морских водорослей. В воде агар-агар растворяется при температуре 80—86°С, застудневает при 36—40°С. Применение агаровых сред благодаря их способности сохранять плотность при температуре 37°С дало возможность выращивать патогенные микробы при оптимальной для большинства из них температуре на плотных средах. Желатин — вещество белковой природы животного происхождения. В теплой воде при температуре 32—34°С он набухает и растворяется, а при более низкой температуре превращается в студень. Однако при рН ниже 6,3 и выше 7,0 плотность желатина уменьшается, и он плохо застывает.

Исходные продукты для приготовления питательных сред. Для приготовления питательных сред используют:

Продукты животного происхождения (мясо, рыба, казеин, молоко, яйца, кровь и т. д.).
Продукты растительного происхождения (картофель и др.).
Органические и неорганические соединения определенного химического состава.

Питательные среды, приготовленные из продуктов растительного и животного происхождения, несмотря на то, что они не могут быть стандартны и не имеют определенного химического состава, находят широкое применение в практике микробиологии. Синтетические питательные среды, составленные из химических соединений, используют преимущественно для изучения обмена веществ микробной клетки.

Требования, предъявляемые к питательным средам. Питательные среды должны:

Содержать необходимые для питания микроба питательные вещества.
Иметь реакцию рН, оптимальную для выращиваемого вида микроба.
Иметь достаточную влажность, так как микробы питаются по законам диффузии и осмоса.
Обладать изотоничностью.
Быть стерильными, обеспечивая тем самым возможность выращивания чистых культур микробов.

Питательные среды подразделяются на среды общего назначения и специальные.

К первой группе относятся мясо-пептонные: агар, бульон, питательный желатин. Среды общего назначения используют для выращивания многих патогенных микробов и применяют в качестве основы для приготовления специальных сред, добавляя к ним кровь, сахар, молоко, сыворотку и другие ингредиенты, необходимые для размножения того или иного вида микроба.

К специальным питательным средам относятся элективные (избирательные) и дифференциально-днагностическне.

Элективные (избирательные) среды. Принцип создания элективных питательных сред основан на удовлетворении основных биохимических и энергетических потребностей того вида микроба, для культивирования которого они предназначены. Определенный состав и концентрация питательных микроэлементов, ростовых факторов при строгом значении рН обеспечивают оптимальные условия для выращивания одного или нескольких видов микроорганизмов. При посеве на них материала, содержащего смесь различных микроорганизмов, раньше всего будет проявляться рост того вида, для которого данная среда будет элективной.

Дифференциально-диагностические питательные среды. Дифференциально-диагностические питательные среды используют для определения видовой принадлежности исследуемого микроба, основываясь на особенностях его обмена веществ. По своему назначению дифференциально-диагностические питательные среды подразделяются следующим образом:

Среды для выявления протеолитической и гемолитической способности микробов, содержащие в своем составе белковые вещества: кровь, молоко, желатин, свернутую кровяную сыворотку и т. д.
Среды с индифферентными химическими веществами, которые служат источником питания для одних видов микробов и не усваиваются другими видами.
Среды с углеводами и многоатомными спиртами для обнаружения соответствующих ферментов.
Среды для определения редуцирующей способности микробов.

В состав дифференциально-диагностических сред, предназначенных для выявления сахаролитических и окислительно-восстановительных ферментов, вводят индикаторы: нейтральный красный, метиленовый синий, лакмусовую настойку, кислый фуксин, бромтимоловый синий, водный голубой краситель и розоловую кислоту. Изменяя свою окраску при различных значениях рН, индикатор указывает на наличие или отсутствие расщепления, окисления или восстановления введенного в среду ингредиента. Однако индикатор не является обязательной составной частью сред, предназначенных для выявления ферментов. Так, наличие желатиназы и других протеолитических ферментов в культуре определяют по разжижению желатина, свернутого яичного или сывороточного белка.

Сухие питательные среды. Приготовление питательных сред — один из наиболее ответственных и трудных участков работы бактериологической лаборатории. В связи с этим биопромышленность выпускает стандартные, консервированные, сухие питательные среды, различного назначения, для культивирования микроорганизмов.

Приготовление обычных питательных сред. Основой для приготовления этих сред служит мясная вода, содержащая экстрактивные вещества.

Посуда. Питательные среды готовят в кастрюлях, эмалированных или из нержавеющей стали. Готовые питательные среды разливают во флаконы, пробирки, чашки.

Новую стеклянную посуду кипятят в 1—2% растворе соляной кислоты для нейтрализации растворимой щелочи, затем тщательно промывают в проточной воде и сушат. Посуду, бывшую в употреблении, стерилизуют, затем моют, прополаскивают и сушат. Сухие флаконы, колбы, пробирки закрывают ватно-марлевыми пробками.

Мясная вода.

500 г свежей говядины или телятины освобождают от костей, жира и сухожилий, пропускают через мясорубку, фарш заливают 1 литром водопроводной воды, хорошо размешивают. Оставляют на сутки в прохладном месте или помещают на 2 часа в термостат.
Мясную пасту отжимают через марлю, кипятят в течение 5 минут. Для свертывания белков дают остыть. Фильтруют через ватный фильтр, доливают водой до первоначального объема. Мясную воду разливают во флаконы, стерилизуют 20-30 минут при 120°С и сохраняют в темном месте. Она имеет вид прозрачной желтоватой жидкости слабокислой реакции (рН 6,2—6,4), без белков. В мясной воде содержится небольшое количество аминокислот, солей, углеводов, факторов роста и экстрактивных веществ. Для приготовления обычных питательных сред к мясной воде прибавляют сухой пептон, который является первичным продуктом гидролиза белка и состоит из смеси полипептидов и аминокислот, полученных путем пептического или триптического переваривания.

На мясокомбинатах для производства сухого пептона используют фибрин, кровь и другие отходы. Сушат пептон в распылительной вакуум-сушилке.

Жидкий пептон можно приготовить в лабораторных условиях путем пептического переваривания белков.

Пептон Мартена. Свиные желудки (не промытые водой) с обильным слизистым слоем очищают от пленок, жира и пропускают через мясорубку. К фаршу прибавляют воду и соляную кислоту в следующем соотношении: фарш из свиных желудков 250 г, вода водопроводная, нагретая до 50°С, 1000 мл, соляная кислота (удельный вес 1,18) 10 мл. Смесь выдерживают в термостате при 50°С. Через 24 часа пептон прогревают в автоклаве при 100°С и фильтруют, фильтрат подщелачивают 10% раствором NaOH до щелочной реакции по лакмусу. После этого фильтрат разливают в колбы и стерилизуют при 115°С 30 минут.

Для приготовления бульона пептон Мартена смешивают с равным объемом мясной воды, устанавливают необходимую реакцию, кипятят 30 минут, фильтруют и стерилизуют при 115°С 30 минут.

Мясо можно переваривать с помощью трипсина — перевар Хоттингера, при этом более полно используют белки мяса, которые расщепляются до пептонов, полипептидов и свободных аминокислот. При триптическом переваривании мяса получают в 10 раз больше бульона, чем при обычном методе.

Мясной перевар Хоттингера. Мясо, освобожденное от жира и сухожилий, нарезают небольшими кусочками, помещают в кастрюлю с кипящей водопроводной водой (в полуторном объеме) и кипятят 15—20 минут, затем мясо извлекают из жидкости и пропускают через мясорубку. Установив рН охлажденной до 40—45°С жидкости, равный 8, заливают ею фарш. К полученной смеси добавляют сухой панкреатин в количестве 0,5—1% или поджелудочную железу из расчета 100 г железы на 1 л жидкости. Затем смесь снова подщелачивают до рН 8 и разливают ее в бутыль. Туда же добавляют 2—3% хлороформа и, закрыв бутыль резиновой пробкой, несколько раз встряхивают содержимое. Бутыль ставят на 7—14 суток при температуре 37°С.

В результате переваривания мясной фарш превращается в гомогенный сероватый осадок, над которым находится совершенно прозрачная жидкость соломенно-желтого цвета. Перевар Хоттингера хорошего качества дает положительную реакцию на триптофан и содержит 560—860 мг% аминного азота. Для приготовления бульона к 1 части перевара прибавляют 6—7 частей воды.

Мясо-пептонный бульон (МПБ).

В 1 л мясной воды растворяют при подогревании и помешивании 10 г пептона (1%) и 5 г (0,5%) хлористого натрия. Рекомендуется брать 3 части хлористого натрия и 2 части двузамещенного фосфорнокислого натрия. Смесь вводится в количестве 0,5%. Фосфорнокислый натрий стабилизирует реакцию среды и служит дополнительным источником фосфора. Устанавливают рН среды до 7,6—7,8, кипятят 30—45 минут до выпадения осадка.
Охлаждают, фильтруют через бумажный фильтр, доливают водой до первоначального объема, проверяют рН.
Разливают по пробиркам, флаконам и стерилизуют 15— 20 минут в автоклаве при 120°С.

Концентрированный мясо-пептонный бульон готовят на особой мясной воде (1 кг мяса заливают 1 л воды). Такой бульон служит для выращивания анаэробных и других микробов.

Мясо-пептонный агар (МПА).

К мясо-пептонному бульону для придания плотности добавляют 2—2,5% мелко нарезанного и промытого агар-агара.

Агар-агар получают путем специальной обработки морских водорослей. Он является веществом полисахаридной природы, содержит незначительное количество азота и не представляет собой питательный субстрат. Студень, образуемый агар-агаром, расплавляется при 70— 100°C и застывает при 40—50°.
Кипятят, помешивая, до полного расплавления агара. В некоторых случаях для просветления среды прибавляют белок одного куриного яйца, смешанного с двойным количеством холодной воды. Среду помещают в автоклав на 45 минут при 115°С. Свернувшиеся хлопья белка адсорбируют взвешенные частицы и осаждаются на дно.
Проверяют и исправляют реакцию среды. Отстаивают и фильтруют через ватно-марлевый фильтр в горячем автоклаве или в специальной металлической воронке с двойными стенками, между которыми находится горячая вода.
Разливают среду через стеклянную воронку с зажимом в пробирки и флаконы и стерилизуют в автоклаве при 120°С в течение 15—20 минут.
Из расплавленного стерильного мясо-пептонного агара приготовляют скошенный и прямой агар (агар столбиком). В первом случае пробирки укладывают горизонтально до полного застывания, во втором — пробирки помещают в штатив вертикально.

В настоящее время бактериологические лаборатории широко используют сухие питательные среды в виде порошков, хранящихся в герметически закрытых банках и пакетах.

Кроме обычных питательных сред (МПБ и МПА), имеются специальные и дифференциально-диагностические среды. Готовят среды по прописи, указанной на этикетке, навеску порошка растворяют в определенном объеме дистиллированной воды, среду разливают в пробирки и стерилизуют при соответствующей температуре. Постоянство состава, стандартность среды, простота и удобство в работе, легкость транспортировки и хранения являются большим преимуществом сухих питательных сред.

Для определения рН плотных питательных сред их расплавляют. Определяют pH с использованием pH-метров или (менее точно) с помощью индикаторной бумаги.

После установления соответствующего рН среду кипятят, фильтруют, осветляют, разливают во флаконы, пробирки и стерилизуют. Следует учитывать, что после стерилизации среда становится более кислой.

Стерилизация питательных сред. Стерилизацию питательных сред осуществляют различными способами в зависимости от тех ингредиентов, которые входят в их состав.

Синтетические среды и все агаровые среды, не содержащие в своем составе нативного белка и углеводов, стерилизуют 15—20 мин в автоклаве при температуре 115—120°С.
Среды с углеводами и молоком (в состав которого входит лактоза), питательный желатин стерилизуют текучим паром при температуре 100°С дробно или в автоклаве при 112°С.
Среды, в состав которых входят белковые вещества (сыворотка крови, асцитическая жидкость), обеспложиваются тиндализацией или фильтрованием.
Для стерилизации питательных сред, содержащих в своем составе нативные белки, пользуются фильтрацией через мембранные фильтры Зейтца.

Подготовленные к употреблению питательные среды проверяют на стерильность. Для этого их ставят в термостат при температуре 37°С. Среды, простерилизованные в автоклаве, выдерживают в термостате 1 сутки, простерилизованные текучим паром — 3 суток.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 ... 16

	Попов А. А., Глухов П. П., Луппа Г. М., Попова О. А. Летний образовательный... Рекомендовано к печати Ученым советом института системных проектов государственного бюджетного образовательного учреждения высшего...		1 Центр тяжести 11 Лабораторная работа №11 Министерство сельского хозяйства Российской Федерации Адамовский сельскохозяйственный техникум – филиал Федерального государственного...
	О центре информационных технологий Центр информационных технологий (далее — цит) является структурным подразделением федерального государственного бюджетного образовательного...		Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения... Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования
	Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения... Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования		Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения... Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования
	Отчет о самообследовании деятельности федерального государственного... Деятельности федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования		Методическое пособие по организации досуга молодежи в рамках туристско-краеведческой... Рецензент: Выдрина Г. А. кандидат философских наук, доцент кафедры менеджмента Федерального государственного бюджетного образовательного...
	О студенческом городке федерального государственного бюджетного образовательного учреждения Студенческое общежитие (далее – студенческое общежитие) федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего...		Учебное пособие по чтению Для студентов заочного отделения 080502, 080507 Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский государственный...
	П. Ф. Еромасова (колледж) филиал Федерального государственного бюджетного... П. Ф. Еромасова (колледж) – филиал Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования		П. Ф. Еромасова (колледж) филиал Федерального государственного бюджетного... П. Ф. Еромасова (колледж) – филиал Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования
	П. Ф. Еромасова (колледж) филиал Федерального государственного бюджетного... П. Ф. Еромасова (колледж) – филиал Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования		Отчет о самообследовании деятельности Федерального государственного... ...
	Программа стратегического развития федерального государственного... Адыгейский государственный университет как классический университет и главный образовательный, культурный, научный и интеллектуальный...		Ульяновский государственный технический университет Положением о закупке товаров, работ, услуг федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования...

Культивирование микроорганизмов

Питательные среды

Похожие: