Лабораторная работа «Пробоподготовка и анализ вещественных доказательств отравления»
|
Скачать 0.5 Mb.
|
 Занятие 10Методология химико-токсикологического анализа Структура занятия:
Целевые задачи:
Краткое теоретическое введение Химико-токсикологические исследования при отравлении токсическими веществами и их метаболитами (алкоголем и его суррогатами, наркотическими средствами, психотропными лекарственными средствами, органическими растворителями и другими веществами, вызывающими интоксикацию, включая токсичные метаболиты) проводятся в несколько этапов: отбор, транспортировка/хранение биологических объектов; подготовка образцов для анализа; качественный и количественный анализ. Кровь для проведения химико-токсикологических исследований отбирается (Приложение 10.1) из поверхностной вены одним из следующих способов: -самотеком в сухой флакон с раствором гепарина (3-5 капель на каждые 10 мл крови). Отбирается 15 мл крови в два флакона объемами 10 и 5 мл. Флаконы закрываются стандартной резиновой пробкой, которая фиксируется алюминиевым колпачком. Содержимое флаконов сразу же перемешивается. Флаконы опечатываются и направляются в ХТЛ для проведения химико-токсикологических исследований на наличие алкоголя и его суррогатов, наркотических средств, психотропных и других токсических веществ, вызывающих опьянение (интоксикацию), и их метаболитов. Флакон с 5 мл крови хранится как контрольный образец. Второй флакон с 10 мл крови (анализируемый образец) используется для проведения химико-токсикологических исследований; - с использованием вакуумных пробирок (одноразовых устройств для ускоренного взятия крови с содержанием гепарина и иглами с двух концов) один конец вводится в вену, другим концом прокалывается резиновая мембрана пробирки. Отбирается 15 мл крови в две вакуумные пробирки по 5 мл и 10 мл (контрольный и анализируемый образцы), пробирки опечатываются. Для химико-токсикологических исследований на наличие алкоголя и его суррогатов, наркотических средств, психотропных и других токсических веществ, вызывающих опьянение (интоксикацию), и их метаболитов обеспечивается доставка образцов крови в ХТЛ не позднее двух суток после отбора. Кровь после отбора до момента отправки в ХТЛ хранится в холодильнике при температуре 0-2°С. Кровь с сопроводительной документацией направляется в ХТЛ в укупоренных и опечатанных флаконах, вакуумных пробирках в специальном контейнере в сумке-холодильнике на транспорте медицинской организации в сопровождении медицинского работника, ответственного за доставку биологических объектов. Отбор мочи производится в условиях, исключающих возможность замены или фальсификации биологического объекта (при освидетельствовании наркотического или алкогольного отравления). Моча собирается в стеклянный или пластмассовый градуированный сосуд с широким горлом объемом до 200 мл в количестве до 100 мл, но не менее 30 мл. Сосуд с мочой передается медицинскому персоналу; его накрывают покровной пластиной (крышкой). В течение первых 5 мин проводится предварительное исследование мочи, включающее определение следующих показателей: температуры стеклянным ртутным термометром (норма 32,5-37,7°С); рН с помощью универсальной индикаторной бумаги для определения рН мочи (норма рН= 4-8); относительной плотности (норма ρ=1.008-1.025 г/см3); содержания креатинина методом иммунной хроматографии (норма 4,4 - 17,7 ммоль/сут). Если при предварительном исследовании выявляется несоответствие указанных в настоящем пункте показателей их нормам, проводится повторный отбор мочи. Результаты предварительного исследования фиксируются в соответствующей графе Журнала регистрации отбора биологических объектов (Приложение 10.2). После проведения предварительных исследований мочу делят на две части (1/3 и 2/3 общего объема) и помещают их в два стеклянных или пластмассовых герметично закрывающихся контейнера объемом 100 мл каждый. Первый контейнер с меньшим количеством мочи хранится как контрольный образец. Второй (анализируемый образец) используется для проведения химико-токсикологических исследований. При направлении мочи для проведения химико-токсикологических исследований на наличие алкоголя, его суррогатов и метаболитов, моча после разделения отбирается из контейнера с анализируемым образцом в чистый сухой флакон объемом 10 мл в количестве не менее 5 мл, закрывается резиновой пробкой, фиксируется алюминиевым колпачком и укупоривается под обкатку. Для проведения химико-токсикологических исследований на наличие алкоголя и его суррогатов, наркотических средств, психотропных и других токсических веществ, вызывающих опьянение (интоксикацию), и их метаболитов моча доставляется в ХТЛ не позднее двух суток после отбора, до отправки в ХТЛ моча хранится в холодильнике при температуре 0-2°С. Отобранная моча с сопроводительной документацией доставляется в ХТЛ в укупоренных и опечатанных контейнерах в сумке-холодильнике на транспорте медицинской организации медицинским работником, ответственным за доставку биологических объектов. При отборе волос их срезают ближе к коже ножницами с закругленными концами отдельно с лобной, теменной, затылочной, правой и левой височных областей волосистой части головы. При невозможности отбора волос с волосистой части головы (облысение), волосы срезаются с подмышечных впадин или лобковой области. Для проведения химико-токсикологических исследований отбирается не менее 300 мг волос. Отобранные образцы волос делятся на две равные части, заворачиваются в фольгу, каждая часть помещается в отдельный конверт с соответствующими надписями: контрольный и анализируемый образцы. Конверты опечатываются и хранятся в сухом месте при температуре 20-25°С до отправки в ХТЛ. Для отобранных биологических объектов готовятся две этикетки, одна из которых предназначена для контрольного образца, другая для анализируемого. На этикетках указывается штрих-код либо шестизначный код освидетельствуемого (для кодирования используется произвольный ряд чисел от 0 до 9, например: 003841, 658097 и т.д.), дата и код подразделения медицинской организации, в которой производится отбор биологических объектов. На этикетке контрольного образца после шестизначного кода либо штрих-кода освидетельствуемого ставится буква "К" (например: 003841-К). Обратная сторона этикеток подписывается освидетельствуемым до указания на этикетках его штрих-кода либо шестизначного кода. Каждая этикетка крепится к флакону (пробирке, контейнеру и пр.) клейкой лентой таким образом, что бы исключить возможность подмены содержимого флакона без нарушения целостности этикетки. Место соединения концов ленты пломбируется и опечатывается с использованием штампа структурного подразделения медицинской организации, в которой проводился отбор биологических объектов. Подготовленные биологические объекты упаковываются в контейнер и с сопроводительной документацией помещаются в сумку-холодильник. Контрольные образцы биологических объектов при поступлении в ХТЛ сразу же помещаются на хранение в запираемые или опечатываемые холодильные шкафы и хранятся при температуре не выше -18°С. Срок хранения контрольного образца - 2 мес со дня поступления в ХТЛ. Если в течение этого срока отсутствовала необходимость в повторных химико-токсикологических исследованиях, то по истечении 2-х месяцев контрольный образец биологического объекта уничтожается. Анализируемые образцы биологических объектов при поступлении в ХТЛ хранятся в течение первых двух суток при температуре 0 - 2°С, далее - при температуре не выше -18°С в запираемых или опечатываемых холодильных шкафах. Правила проведения химико-токсикологического анализа включают обязательное оформление специального документа – Направления на химико-токсикологические исследования (Приложение 10.3). В этом документе следует сообщать максимум подробностей: наименование медицинской организации и его структурного подразделения, выдавшего направление; фамилию, имя, отчество освидетельствуемого или пострадавшего и его возраст; дату и время отбора пробы и условия ее хранения; дату отправки биологических объектов в ХТЛ предварительный клинический диагноз; цель химико-токсикологических исследований. Следует обратить внимание химика-токсиколога на обнаружение какого вещества (лекарственного средства) или группы веществ требуется провести исследования в первую очередь Справка о доставке биологических объектов на химико-токсикологические исследования подписывается руководителем ХТЛ. В справке указываются результаты осмотра биологических объектов заведующим ХТЛ, дата и время их доставки, и в случае несоответствия упаковки, несоблюдении условий хранения биологических объектов после отбора и при их транспортировке, при неправильном оформлении сопроводительной документации выявленные несоответствия фиксируются в соответствующем разделе. (Приложение 10.4). План химико-токсикологического анализа определяется предварительным клиническим диагнозом или направлением врача скорой помощи. При судебно-химическом исследовании химик-эксперт ориентируется в первую очередь на материалы дела, изложенные в постановлении органов дознания. Кроме того, во внимание принимаются данные других сопроводительных документов − выписки из истории болезни, акта вскрытия трупа и др. Осмотр и описание вещественных доказательств отравления. Следует иметь в виду, что объекты ХТА предстапвляют большую ценность для судебно-следственных органов, судебных медиков, врачей-токсикологов Объекты ХТА отбираются для анализа на определенной стадии отравления, например, на скрытой или токсикогенной и поэтому представляют собой единичные экземпляры. Желудок, печень, почка, кровь, моча и любой другой трупный материал, также кровь, моча, рвотные массы, промывные воды желудка погтерпевшего не могут быть взяты для анализа повторно, на той же стадии отравления или в тот же момент после гибели человека. Для проведения судебно-химической экспертизы должно расходоваться не более 1/3 объекта, вторая треть материала может быть израсходована (при необходимости) для проверочного исследования и уточнения количественного определения. Оставшуюся треть материала необходимо вернуть в учреждение, направившее материал на судебно-химическое исследование, или хранить в соответствии с Приказом МЗ РФ от 24 апреля 2003 г № 161. Как уже отмечалось, в химико-токсикологической лаборатории обязательно ведение журнала регистрации ХТА (см. Приложение 10.2). Журнал является юридическим документом. Страницы журнала должны быть пронумерованы и прошнурованы. В журнале отражается следующая информация: название, номер и дата сопроводительного документа к поступившему на анализ образцу; дата, номер анализа, фамилия и инициалы потерпевшего (освидетельствуемого); номер истории болезни; предполагаемый диагноз; название отделения лечебного учреждения; описание объекта исследования; цель исследования; время начала и окончания анализа; метод исследования; результат проведенного анализа; подпись химика-эксперта, выполнявшего анализ. При осмотре поступивших на анализ проб указывают растворитель (консервант), в который помещен доставленный образец; описывают внешний вид, фазовое состояние (кристаллическое, аморфное, жидкое), цвет, запах, вязкость, летучесть. При хранении пробы в консерванте дополнительно должна прилагаться его проба. Консервация формалином, глицерином, фенолом и другими веществами рассматривается как «преступная» халатность. Такое вещество, как формалин, само является ядом и входит в круг химического исследования при отравлениях. Кроме того, формальдегид вступает в реакции с такими токсикантами, как аммиак и циановодорродная кислота; затрудняет обнаружение метанола (идентификация метанола включает реакцию превращения его в формальдегид) и ряда других веществ. При обнаружении неправильно выбранного консерванта необходимо составить акт с указанием его возможного влияния на результат химического анализа. Акт пересылают в организацию, направившую объекты в химическую лабораторию. При описании запаха принимают во внимание, что специфический запах имеют ментол, метилсалицилат, камфора, ксероформ, некоторые витамины, формалин, бензин, керосин, ароматические и хлорированные углеводороды, эфиры этиленгликоля, солод и другие вещества. Для фенолов характерен специфический «фенольный» запах. Ацетон, хлороформ имеют «сладковатый» запах. Для алифатических спиртов характерен спиртовой, а для их эфиров – фруктовый запах. Кислоты - азотная, соляная, хлорная, уксусная, трихлоруксусная, муравьиная вызывают раздражение слизистой оболочки дыхательных путей. Гидриды фосфора теллура, мышьяка и других p-элементов имеют чесночный запах. Фиалковый запах мочи наблюдается при отравлении скипидаром. Запах ацетона - при отравлении изопропанолом, ацетоном. Следует помнить, что запах ацетона характерен для мочи больных сахарным диабетом. Окраска исследуемого объекта также помогает в предварительной идентификации вещества, вызвавшего отравление. Вещественные доказательства желтого цвета – это производные нитрофурана, нифедипин, но-шпа, нистатин, меркаптопурин, антибиотики группы тетрациклина, тавегил, леворин, риванол, пикриновая кислота и др. Желто-оранжевую окраску имеют витамин В2, фолиевая кислота, калия дихромат. Желто-зеленая окраска характерна для рутина, зеленая - для бриллиантового зеленого, для кобаламина – розовая, рубомицина - красного. Красный цвет с коричневатым оттенком характерен для ферроцерона. Калия перманганат имеет красно-фиолетовую окраску. Кристаллы йода окрашены в темно-фиолетовый цвет с характерным металлическим блеском, растворы йода имеют темно-коричневую окраску. В ходе визуального осмотра содержимого желудка отмечают его цвет. Пурпурная или розовая окраска содержимого может быть связана с отравлением перманганатом калия. При отравлении солями меди содержимое желудка пострадавшего окрашено в зеленый или голубой цвет, солями никеля – в зеленый, солями кобальта — в розовый цвет. Окрашивание содержимого желудка в желтый цвет позволяет предположить отравление азотной или пикриновой кислотой. Кислоты серная, соляная, щавелевая придают исследуемому материалу цвет кофейной гущи, а йод — сине-коричневое окрашивание. Красно-коричневый цвет моча имеет при отравлении производными пиразола, фенотиазина. Фенол и метиленовая синь меняют цвет мочи на зелено-синий, а фенацетин, рибофлавин, производные нитрофурана, пикриновая кислота — на желтый. После визуального осмотра мочи проводят предварительные хромогенные реакции (цветные тесты) с отдельными ее порциями (Приложение 10.5). В случае отрицательного результата дальнейшее исследование на необнаруженные группы токсикантов не проводят. Необходимо отметить, что, кроме лекарственных веществ, в некоторые лекарственные формы входят вспомогательные вещества, консерванты, стабилизаторы. Они могут мешать определению основных токсикантов, что иногда приводит к ошибочным заключениям. Подготовка биопробы к анализу. Идентификации токсиканта (качественному анализу) и его количественному определению предшествует пробоподготовка, включающая изолирование (извлечение) яда, отделение мешающих проведению анализа компонентов биопробы, концентрирование определяемых веществ. При проведении ХТА возникают трудности, связанные с низким содержанием определяемого вещества на фоне большого количества эндогенных веществ – белков, пептидов, липидов, углеводов, стероидов, пигментов и др. Поэтому основная задача этого этапа анализа - снизить до минимума содержание фоновых веществ и добиться максимально возможного концентрирования определяемых веществ. Пробоподготовка является наиболее трудоемким этапом анализа и содержит главные источники ошибок его результат. Пробоподготовка должна выполняться очень аккуратно и последовательно с учетом дальнейшего метода идентификации и количественного определения яда. Пробоподготовка тканей различных органов включает несколько стадий. Полученные для анализа почка, части печени, мозга, кишки, лоскуты кожи и др. необходимо измельчить. Измельчение до размера частиц 0,5-2 см2 можно проводить ножницами; растиранием в ступке с песком, стеклом, солями; с помощью ножевых гомогенизаторов или современных высокоскоростных турбин - ультратураксов. Обработка биоматериалов ультразвуком приводит к разрушению структурной целостности клеток и их мембранных структур. Лиофилизация, или обезвоживание, проводится с использованием обезвоживающих веществ (натрия сульфата, гипса) под вакуумом в эксикаторах или с помощью лиофильных сушек (сублимационное высушивание замороженного материала под вакуумом). Замораживание осуществляется при температуре -5÷-15ºС. Депротеинирование биоматериала, удаление белков, возможно при обработке его этанолом (абсолютным или 96%) – фрагмент метода Стаса=Отто, органическими растворителями (ацетоном или ацетонитрилом) – фрагмент «ацетонового метода», кислотами (соляной, хлорной, трихлоруксусной и др.), солями (вольфроматами, сульфатами, нитратами, фосфатами, хлоридами и др.). Возможно проведение ферментативного депротеинирования. Удаление липидов из биоматериала проводят экстракцией органическими растворителями, методом колоночной хроматографии или препаративной ТСХ; сепарацией липидов, вымораживанием исследуемых образцов. Таким образом, при пробоподготовке достигается нарушение целостности ткани и клеточных структур, обеспечивается обезвоживание, отделение белков и липидов, что приводит к последующему более полному изолированию определяемых веществ и их концентрированию в анализируемой пробе. Эти предварительные операции снижают нижние пределы определения и количественной оценки (занятие 11) токсичного вещества в биопробе. Изолирование токсического вещества из биоматериала чаще всего проводят жидкостной экстракцией. Теоретические основы этого метода подробно рассмотрены в Учебнике (с. 62-74, 162-167) и Практикуме (занятие 5). Распределение токсического вещества между двумя фазами в первую очередь зависит от его липофильности/гидрофильности, определяемой степенью ионизации, являющейся функцией рН жидких фаз. Количественно жидкость-жидкостная экстракция может быть оценена коэффициентом распределения ксенобиотика между органической и водной фазами. Именно поэтому в химико-токсикологическом и судебно-химическом анализе традиционно используют многостадийную экстракцию органическими растворителями токсикантов кислотной и основной природы при различных значениях рН, с последующей реэкстракцией водными растворами с низкими и высокими значениями рН. Например, при жидкость-жидкостной экстракции мочи для изолирования предположительно содержащихся в ней соединений с гетероциклическим атомом азота (органические основания), отдельные ее порции смешивают с органическими растворителями при разных значениях рН среды. Щелочное извлечение исследуют на наличие ксенобиотиков основной природы - производных 1,4=бензодиазепина, морфина, кодеина и др. Полученные экстракты испаряют на часовых стеклах. Сухие остатки рассматривают визуально и под микроскопом. Каждый из остатков исследуют методом хроматографии в тонком слое (ТСХ), в том числе в системах, предложенных Международным комитетом по систематическому токсикологическому анализу; выполняют цветные тесты; проводят анализ с использованием спектральных методов. Для определения летучих ядов, например, органических растворителей, применяют парофазную экстракцию – перевод определяемого вещества в газовую фазу. Такой метод изолирования применяется при использовании метода ГЖХ. Широкое распространение получил метод твердофазной экстракции – адсорбции токсического вещества на твердом сорбенте с последующим элюированием растворителем (рис. 10. 1). Развитие этого метода достигло такого совершенства, что позволяет разделять на специфических сорбентах энантиомеры органических веществ, в том числе лекарственных, отличающиеся по своим биологическим эффектам.  |
Похожие:
 |
Лабораторная работа 1 4 лабораторная работа 2 13 лабораторная работа... Интернете разнообразную информацию – описательную, графическую, картографическую и пр. При разработке сайтов необходимо уметь работать... |
 |
Лабораторная работа №9 59 Лабораторная работа №10 72 Лабораторная... Рабочая тетрадь для выполнения лабораторных работ по мдк. 03. 01. «Техническое обслуживание и ремонт компьютерных систем и комплексов»... |
|
Современное состояние экспертизы вещественных доказательств биологического... Работа выполнена в фгбу «Российский центр судебно-медицинской экспертизы» Минздравсоцразвития России |
|
Методические указания для студентов по выполнению лабораторных работ... Лабораторная работа 4, 5 Исследование регистров, счетчиков и дешифраторов Лабораторная работа 6, 7 Исследование генератора псевдослучайной... |
|
Обобщение по своевременности и правильности исполнения судебных решений... Лем Ленинского районного суда г. Орска 31 декабря 2014 года, проведено обобщение «По своевременности и правильности исполнения судебных... |
|
Лабораторная работа №10. Изучение принципа действия и функциональной... Лабораторная работа № Изучение принципов построения системы автоматической подстройки частоты (апч) радиолокационной станции |
|
Отравления ядовитыми грибами Отравления грибами начинают регистрироваться ранней весной и в период. В зависимости от появления первых клинических симптомов отравления... |
|
Лабораторная работа №1 «Создание общих ресурсов и управление ими» Лабораторная работа №6-7 «Изучение типов серверов, их настройка и конфигурирование» |
|
Верховный суд СССР Направляется для использования в практической деятельности единая Инструкция о порядке изъятия, учета, хранения и передачи вещественных... |
|
Лабораторная работа № Лабораторная работа №1. Изучение основных возможностей программного продукта Яндекс. Сервер. Установка окружения, установка и настройка... |
|
Лабораторная работа №27 Лабораторная работа №28 Контрольные работы... Пм «Сборка монтаж (демонтаж) элементов судовых конструкций, корпусов, устройств и систем металлических судов» |
|
Лабораторная работа №9 Данная лабораторная работа оформляется в виде файла word с расширением файла docx или doc и прикрепляется в виде ссылки на файл к... |
|
Лабораторная работа 2 12 лабораторная работа 3 17 лабораторная работа... «Проектирование систем реального времени» для студентов специальности 09. 05. 01 «Применение и эксплуатация автоматизированных систем... |
|
Высшего профессионального образования «ставропольская государственная... Методические рекомендации предназначены для студентов лечебного, педиатрического и стоматологического факультетов, врачей-интернов,... |
|
Лабораторная работа «Построение контуров изображения с использованием... Ивших на уроках математики понятие о математических кривых и графиках функций. Данная лабораторная работа может быть использована... |
|
Практическая работа Содержание Лабораторная работа: Оценка программно-аппаратных средств при переходе на Windows Vista 3 |