Клеточные и гуморальные механизмы опухолеспецифической иммунотерапии и их модуляция под влиянием гипертермии
|
Скачать 330.65 Kb.
|
На правах рукописи КАЩЕНКО Эрика Александровна КЛЕТОЧНЫЕ И ГУМОРАЛЬНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ОПУХОЛЕСПЕЦИФИЧЕСКОЙ ИММУНОТЕРАПИИ И ИХ МОДУЛЯЦИЯ ПОД ВЛИЯНИЕМ ГИПЕРТЕРМИИ 14.00.36 - Аллергология и иммунология Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Новосибирск 2009 Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте клинической иммунологии Сибирского отделения Российской академии медицинских наук Научный руководитель: доктор медицинских наук Селедцова Галина Викторовна Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Аутеншлюс Александр Исаевич доктор биологических наук, профессор Уразова Людмила Николаевна Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Сибирский Государственный медицинский университет Росздрава Защита состоится «24» декабря 2009г. в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 001.001.01. «Аллергология и иммунология» при НИИ КИ СО РАМН (630099, г. Новосибирск, ул. Ядринцевская, 14). С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ КИ СО РАМН (630099, г. Новосибирск, ул. Ядринцевская, 14). Автореферат разослан «____» ______________ 2009 г. Ученый секретарь д  иссертационного советадоктор биологических наук Кудаева О.Т. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ. Актуальность проблемы. Злокачественные новообразования являются одной из наиболее сложных медико-социальных проблем современного общества. По данным ВОЗ, ежегодно в мире регистрируется около 9 млн. новых случаев злокачественных новообразований. В России на конец 2008 года на учете в медицинских онкологических учреждениях состояло 2,6 млн. человек. Средний ежегодный показатель смертности от рака составляет около 300 тысяч человек. Традиционные методы лечения злокачественных заболеваний включают оперативное вмешательство, лучевую и химиотерапию. В настоящее время считается, что общепринятые методы достигли предела своего технического совершенства, и их дальнейшая разработка не приведет к кардинальному изменению ситуации. В связи с этим все больше внимания приобретают альтернативные методы лечения онкологических больных, одним из которых является активно развивающаяся в последнее время иммунотерапия [Моисеенко В.М., 2001; Молчанов О.Е., 2001; Демидов Л.В., 2003; Балдуева И.А., 2003; Коростелев С.А., 2003; Северин Е.С., 2006; Телетаева Г.М., 2007]. Опухолеспецифическая иммунотерапия привлекает особое внимание иммунологов и онкологов. Это связано с многочисленными доказательствами наличия на клетках опухолей опухолеассоциированных антигенов (ОАА) различного происхождения, способных индуцировать развитие эффективного специфического противоопухолевого иммунного ответа [Naftzger C., 1996; Колесник Е.А., 1999; Коростелев С.А., 2003; Тащиев Р.К., 2006]. Посредством различных механизмов опухолевые клетки способны избегать иммунного надзора. Поэтому основная задача опухолеспецифической иммунотерапии – индукция/усиление иммунного ответа, направленного на распознавание и элиминацию злокачественных клеток. Это достигается при помощи вакцинации организма иммуногенными опухолевыми антигенами [Greten T.F., 1999; Моисеенко В.М., 2001; Yu Z., 2002; Dols A., 2003; Sosman J.A., 2003; Berzofsky J.A., 2004; Селедцов В.И., 2006]. В большинстве своем ОАА являются дифференцировочными или онкофетальными. В то же время опухолеспецифические антигены (ОСА), образуются в результате мутаций, как правило, типичных, для различных опухолей. И те и другие являются “общими”, поскольку могут экспрессироваться на разных опухолях. Сам по себе этот факт подразумевает возможность создания универсальных противоопухолевых вакцин. Хорошо известно, что развитие иммунного ответа на одну или несколько опухолеассоциированных детерминант зачастую не приводит к замедлению развития опухолевого процесса, а лишь дает селективные преимущества для роста тем опухолевым клеткам, которые не экспрессируют эти детерминанты [Srinivasan R., 2004]. В связи с этим, иммунизация организма полиантигенными опухолевыми клетками выглядит более предпочтительной, поскольку позволяет индуцировать иммунные реакции на широкий спектр опухолевых антигенов [Foon K.A., 1999; Ward S., 2002]. Эффективность клеточного и гуморального ответа в значительной степени зависит от генетической чужеродности иммунизирующего субстрата. В частности, показано, что иммунизация организма ксеногенными опухолевыми клетками способна прервать исходно существующую иммунологическую толерантность к аутологичным опухолевым антигенам. При этом противоопухолевая протекция достигается за счет индукции как CD8+ T– клеточного, так и гуморального ответа [Naftzger C., 1996; Strehl J., 1999; Wei Y.Q., 2000; Luo F., 2001; Graf N., 2003]. Такая перекрестная реакция объясняется высокой степенью гомологии между ОАА человека и животных [Johnston D., 1994; Bloom M.B., 1997; Steitz J., 2000]. Упомянутые выше данные создали теоретическую основу для создания противоопухолевых ксеногенных полиантигенных вакцин. Одна из них разработана в нашем институте. Она состоит из мышиных меланомных и карциномных опухолевых антигенов. В клинических исследованиях показана ее эффективность в лечении продвинутых форм меланомы и колоректального рака [Селедцов В.И., 2006; Фельде М.А., 2006; Seledtsov V.I., 2006, 2007]. Злокачественная опухоль обладает значительным иммунодепрессивным потенциалом, преодолеть который посредством только антигенных воздействий во многих случаях не представляется возможным. Наше внимание привлекла возможность усилить противоопухолевый эффект вакцинотерапии с помощью гипертермии. В действительности, использование гипертермии в лечении опухолевых заболеваний вызывает особый интерес в силу своей высокой эффективности и общедоступности [Осинский С.П., 2002; Akria I., 2003; Potapnev M.P., 2004; Потапнев М.П., 2004; Исмаил-заде Р.С., 2006]. Показано, что гипертермия способна индуцировать апоптоз в опухолевых клетках, а также значительно усиливать противоопухолевое действие химиотерапевтических средств [Falk M.H., 2001; Luchetti F, 2003]. Имеются данные об иммуномодулирующих свойствах гипертермии [Downing J.F., 1988; Kappel M., 1991;Fuggetta M.P., 2000; Осинский С.П., 2002]. Цель работы – исследовать механизмы противоопухолевого действия вакцин, полученных на основе ксеногенных и сингенных опухолевых антигенов, в монотерапии и в сочетании с гипертермией у мышей с меланомой В16. Задачи исследования: 1. Определить влияние вакцинации ксено- и сингенными опухолевыми антигенами и гипертермического воздействия на продолжительность жизни экспериментальных мышей с меланомой В16. 2. Охарактеризовать выраженность и направленность иммунных реакций при использовании вакцинотерапии и гипертермического воздействия по уровню IFN-γ и IL-4, и антиген-индуцированной пролиферации спленоцитов. 3. Оценить влияние вакцинотерапии и гипертермического воздействия на выраженность инфильтрации опухоли иммунокомпетентными клетками, и степень некроза/апоптоза опухолевых клеток. 4. Оценить формирование специфических антител класса IgG к белкам меланомы В16 у вакцинированных животных. 5. В системе in vitro сравнить влияние гипертермического воздействия 390-43,50С на жизнеспособность и пролиферативную активность спленоцитов мышей и клеток меланомы В16. Научная новизна работы. В работе впервые показана важная роль иммунных реакций, опосредуемых Тh 2 типа, в развитии противоопухолевого ответа у ксеновакцинированных мышей с меланомой. Отмечена положительная связь между продолжительностью жизни ксеновакцинированных мышей с меланомой, уровнем инфильтрации опухоли нейтрофилами и увеличением некроза/апоптоза опухолевых клеток. Зарегистрирована индукция IgG антител, специфичных к антигену меланомы. В работе также впервые показано негативное влияние гипертермии на развитие индуцированных ксеновакцинацией иммунных реакций. Теоретическая и практическая значимость работы. Развитие протективного иммунного ответа при меланоме, преимущественно Th2 типа, указывает на перспективность дальнейшего исследования гуморального звена иммунитета в противоопухолевом ответе. Полученные данные подтверждают эффективность и возможность использования ксеновакцинотерапии в лечении онкологических заболеваний. Связь инфильтрации опухоли нейтрофильными лейкоцитами со степенью некроза/апоптоза опухолевых клеток и увеличением средней продолжительности жизни мышей с меланомой свидетельствует о возможности использования данных критериев в качестве прогностического фактора, а также подчеркивает значимость неспецифического звена иммунитета в механизмах противоопухолевой защиты. Отсутствие эффекта гипертермии как в виде моновоздействия, так и в сочетании с вакцинотерапией, а также обнаруженное негативное влияние гипертермии на пролиферацию клеток иммунной системы, показывают нецелесообразность ее использования в противоопухолевой терапии. В целом, полученные экспериментальные данные призваны способствовать осознанному внедрению методов опухолеспецифической иммунотерапии в лечении злокачественных заболеваний, особенно тех (например, диссеминированная меланома), которые не поддаются стандартному лечению. Основные положения, выносимые на защиту. 1. Полиантигенная ксеновакцинация более эффективна, в сравнении с полиантигенной сингенной вакцинацией, в индукции противоопухолевых, циторедуктивных иммунных реакций. 2. Опосредуемые Тh 2 типа реакции играют важную роль в сдерживании опухолевого роста у экспериментальных мышей с меланомой на поздних стадиях заболевания. 3. Гипертермия оказывает негативное влияние на развитие вакцинальных противоопухолевых реакций. Объем и структура диссертации. Диссертация написана в традиционном стиле и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения и выводов. Материал изложен на 117 страницах машинописного текста, включающего 16 рисунков и 10 таблиц. Прилагаемая библиография содержит ссылки на 196 литературных источника (159 зарубежных). Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на Всероссийской научно-практической конференции «Дни иммунологии в Сибири» (Красноярск, 2005), VII отчетной конференции НИИ КИ СО РАМН. (Новосибирск, 2006), научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Сибири» (Томск, 2008). Апробация диссертации состоялась 05 мая 2009 года на расширенном семинаре НИИ КИ СО РАМН. Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 печатных работ, из них 4 статьи в журналах, определенных ВАК РФ для публикации научных результатов диссертации на соискание ученой степени кандидата наук. Работа выполнена в лаборатории клеточных биотехнологий НИИ КИ СО РАМН, руководитель лаборатории – д-р мед. наук Селедцова Г.В. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. Животные. Эксперименты проводили на взрослых (4-5 месяцев) апатогенных мышах линии С57BL/6 (В6, Н-2b), получены из питомника лабораторных животных “Рассвет” СО РАМН (г. Томск), или из питомника СО РАМН (г. Новосибирск). Мыши содержались в соответствии с правилами Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для научных целей. По окончании эксперимента животных забивали методом цервикальной дислокации с соблюдением «Правил работ с использованием экспериментальных животных», утвержденных приказом МЗ России. Культивирование опухолевых клеток. Опухолевые штаммы меланомы мыши В16 (Н-2b) и меланомы человека Bro были получены из Онкологического научного центра РАМН (г. Москва). Опухолевые клетки сохраняли пассированием in vitro в пластиковых флаконах («Costar», США) в среде RPMI 1640, содержащей 5 мМ HEPES, 2 мМ L-глютамин и антибиотики (Sigma, США), а также 10% инактивированной фетальной сыворотки крупного рогатого скота («Gibco» BRL, США) в атмосфере с 5% СО2, при 370С. Методика приготовления сингенной и ксеногенной вакцины. Опухолевые клетки мышиной меланомы В16 и человеческой меланомы Bro, пассировали в среде RPMI 1640, содержащей 10% сыворотки плодов коров, 5 мM L-глютамина и антибиотики. Монослой клеток снимали с поверхности культурального флакона посредством 5-15 минутной экспозиции в растворе с 0,25 % трипсином и 0,25 % ЭДТА в соотношении 1:1. После отмывки и подсчета клетки 5-кратно замораживали-оттаивали, и полученный лизат далее использовали в качестве вакцины в дозе, эквивалентной 5х106 клеток/мышь. Схема эксперимента. Для индукции опухолевого роста клетки меланомы В16 (5х105 клеток/мышь) имплантировали под кожу передней брюшной стенки животных. Подкожную вакцинацию сингенной или ксеногенной вакциной проводили трижды, начиная с 3-х суток после инокуляции опухоли с интервалом 3-5 суток. Было сформировано 8 групп животных по 10 мышей в каждой. Мыши выводились из эксперимента на 14 сутки после перевивки опухоли. Гипертермическое воздействие. В предварительных экспериментах нами установлено, что используемая в клинической практике гипертермия 430-450С (45-60 мин.), приводит к гибели животных. В связи с этим, использовалось кратковременное гипертермическое воздействие при температуре 420С в течение 10 минут. Гипертермическое воздействие проводилось однократно на 7 сутки после инокуляции опухоли. Мышей, помещенных в пластиковые контейнеры, закрытые непрозрачным укрывным материалом, нагревали с помощью электрической лампы мощностью 300 Вт, закрепленной на расстоянии 28 см от дна контейнера. У животных измерялась ректальная температура в динамике. До начала воздействия она составила 38,60С, через 10 минут достигла максимума 42,30 С, и через 15 минут после окончания температурного воздействия возвращалась в исходное состояние. In vitro стеклянные флаконы с опухолевыми клетками нагревались на водяной бане в течение 45 минут при температуре 390, 410, 42,50, 43,50 (С). Контрольная температура составила 370С. Получение клеточных суспензий. Суспензии клеток селезенки мыши получали посредством гомогенизации фрагментов ткани в охлажденной среде. После осаждения недиссоциированных клеточных конгломератов, клетки отмывали средой RPMI 1640. Определение количества клеток в суспензии и их жизнеспособности проводился по общепринятой методике с использованием в качестве красителя 1% раствор трипанового синего на изотоническом физиологическом растворе. При использовании трипанового синего окрашиваются только погибшие и с поврежденной мембраной клетки. Подсчет клеток проводился в камере Горяева и вычислялся по следующей формуле: Х = К х А х 104, где: К– разведение; А – количество клеток в 25 больших квадратах камеры. Оценка клеточного цикла спленоцитов и клеток опухоли В16. В культуру клеток селезенки добавляли Con А в концентрации 5 мкг/мл. Через 48 часов происходит увеличение количества клеток, находящихся в фазе S/M до 68% и уменьшение в фазе G0/G1-31%. Уровень апоптоза не изменяется. Этот показатель приближается к аналогичному показателю опухолевых клеток. Пролиферативные тесты. Клетки селезенки (2x105/лунку) культивировали в круглодонных 96-луночных планшетах в течение 72 часов в среде RPMI 1640, содержащей 5% сыворотки плодов коров, 5 мМ L-глютамина, 2 х 105 М 2-меркаптоэтанола и антибиотики (все реагенты компании Sigma, США). В опытных пробах клетки культивировали в присутствии лизата опухолевых клеток В16 (25х103/лунку). В контрольных сериях экспериментов клетки культивировали без добавок. В экспериментах, оценивающих непосредственное влияние ГТ 390- 43,50С на опухолевый рост in vitro, клетки В16 после гипертермического воздействия культивировали в течение 24 часов при 370 С. Во всех экспериментах за 6 часов до окончания культивирования в лунки вносили [3H]-тимидин (0.75 мкКи/лунку). Уровень пролиферативной клеточной активности определяли, используя стандартную процедуру учета радиоактивности с помощью β-счетчика. Индекс стимуляции (ИС) вычисляли по формуле: ИС = опыт (имп/мин) / контроль (имп/мин). |
Похожие:
 |
Содержание ... |
 |
Джон Колеман Комитет 300. Тайны мирового правительства Бывшие и ныне действующие учреждения и организации комитета 300, а также те, которые находятся под непосредственным его влиянием |
|
Джон Колеман Комитет 300. Тайны мирового правительства Бывшие и ныне действующие учреждения и организации комитета 300, а также те, которые находятся под непосредственным его влиянием |
|
Основы физической культуры Физическая культура Физическая культура воздействует на жизненно важные стороны индивида, полученные в виде задатков, которые передаются генетически... |
|
Инструкция к заданиям первого, практического тура Продолжительность жизни хвои у сосны составляет 3-4 года; за это время она накапливает такое количество сернистого газа, которое... |
|
1Требования к средствам индивидуальной защиты органа слуха Высокий уровень шума на производстве – вредный производственный фактор. Под его влиянием нарушается сложная регулирующая функция... |
|
Данный метод может применяться для измерения концентраций свободного... Т4 не имеет собственной активности, а служит только в качестве прогормона для Т3 Циркулирующие уровни Т3 находятся под влиянием изменений... |
|
Санитарно-эпидемиологические правила сп 3 3332-16 Илп, предназначенных для иммунопрофилактики, иммунотерапии и диагностики болезней и аллергических состояний, при их транспортировании... |
|
На процесс формирования когнитивных карт пространства Оценка искажений пространственных представлений проводилась при помощи метода отображения и анализа карт-обзоров пространства. Результаты... |
|
Конвенция о безопасности и гигиене труда и производственной сфере (Конвенция 155) Работодатели должны обеспечивать, насколько это обоснованно и практически осуществимо, чтобы находящиеся под их контролем рабочие... |
|
Американские врачи солидарны с отечественными в том, что тамифлю... Да и врачи из фирмы-производителя также не сомневаются в этом. Подобная статистика привела к тому, что в Стране Восходящего Солнца... |
|
Ильин В. А. И 49 Археология детства: Психологические механизмы семейной жизни И 49 Археология детства: Психологические механизмы семейной жизни — М.: Независимая фирма “Класс”, 2002. — 208 с. — (Библиотека психологии... |
|
Настройка телевизионных приёмников некоторых моделей и dvb-c приставки... Настраиваем параметры "Частота начала 474000", "Частота окончания 498000", "Модуляция 128qam" и "Скорость передачи 6975" |
|
Список частот цифрового вещания: Частота: 770 mhz Модуляция: 256qam... Для настройки встроенного dvb-c тюнера для приема программ цифрового кабельного телевидения необходимо использовать следующие параметры... |
|
Диссертация на тему: Организационно-педагогические механизмы формирования... На тему: «Организационно-педагогические механизмы формирования многоуровневой модели непрерывного профессионального образования в... |
|
Инструкция по технике безопасности перед началом работы необходимо... Ется использовать инструмент со снятой крышкой или отвернутыми винтами ее крепления. Если крышка и винты были предварительно демонтированы,... |