                                                                    Санкт-Петербургский Государственный университет
ЕРЫКАЛИНА ИННА АЛЕКСАНДРОВНА
ЭКСПРЕССИЯ ПРОСТАГЛАНДИНА Е2 И СОСУДИСТЫХ ФАКТОРОВ В ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫХ ОРГАНАХ ЧЕЛОВЕКА В РАННЕМ ПОСТНАТАЛЬНОМ ОНТОГЕНЕЗЕ
Выпускная квалификационная работа
по направлению подготовки «эмбриология»
основная образовательная программа магистратуры «биология»
Работа выполнена в лаборатории клеточной биологии
ФГБНУ «НИИ акушерства, гинекологии
и репродуктологии им. Д.О. Отта»
Научный руководитель:
Заведующий кафедрой эмбриологии СПБГУ
к.б.н, доцент. Костюченко Р.П.
Научный консультант:
Руководитель лаборатории клеточной биологии д.б.н., профессор РАН Полякова В.О.
Санкт-Петербург
2017СОДЕРЖАНИЕ
|
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
|
4
5
7
|
1.1. Тимус
|
7
|
1.2. Селезенка
1.3. Лимфатические узлы
|
12
16
|
1.4. Маркеры
|
19
|
1.4.1. CD34
|
19
|
1.4.2. Кисспептин и его рецептор
1.4.3. Простагландин E2 и его рецептор
|
23
29
|
Глава 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
|
39
|
2.1. Материалы исследования
|
39
|
2.2. Методы исследования
|
40
|
2.2.1. Гистологические методы исследования
|
40
|
2.2.1.1. Иммуногистохимическое окрашивание
|
40
|
2.2.1.2. Окраска препаратов гематоксилином и эозином
|
41
|
2.2.2. Методы интерпритации полученных данных
|
41
|
2.2.2.1.Морфологический анализ
2.2.2.2.Статистический анализ результатов исследования
|
41
41
|
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ
|
43
|
3.1. Анализ экспрессии маркера кисспептин и его рецептора
3.1.1. Анализ изображений
3.1.2. Статистический анализ
3.2. Анализ экспрессии маркера CD34
3.2.1. Анализ изображений
3.2.2. Статистический анализ
|
43
43
55
57
57
63
|
3.3. Анализ экспрессии маркера простагландин Е2 и его рецептора
3.3.1. Анализ изображений
3.3.2. Статистический анализ
|
70
70
70
|
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
|
73
|
ВЫВОДЫ
|
77
|
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
|
78
|
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ
АК
АТФ
ГнРГ (GnRH)
ГСК
ИИГ
КЛСМ
ЛГ
НЭЖК
ПАЛВ
ПЦР (PCR)
ФСГ
цАМФ
ЦНС
ЦОГ
КР, KiSS1
KiSS1R
PBS
Pr
PrE2
PrE2R
RT
ТХА2
NK-клетки
Treg
R
r
|
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
|
арахидоновая кислота
аденозин трифосфат
гонадотропин-релизинг гормон
(gonadotropin-releasing hormone)
гемопоэтические стволовые клетки
идиопатический гипогонадотропный гипогонадизм
конфокальная лазерная сканирующая микроскопия лютеинизирующий гормон
неэтерефицированные жирные кислоты
периартериальные лимфатические влагалища полимеразная цепная реакция
фолликулостимулирующий гормон
циклический аденозинмонофосфат
центральная нервная система
циклооксигеназа
kisspeptin
kisspeptin receptor
phosphate buffered saline (натрий-фосфатный буфер)
простагландины
prostaglandin E2
prostaglandin E2 receptor
room temperature (комнатная температура)
тромбоксан А2
натуральные киллеры (natural killer cells)
Т-регуляторные клетки
сумма рангов для критерия Фридмана
коэффициент линейной корреляции Пирсона
|
ВВЕДЕНИЕ
В критические моменты развития организма происходят события, влияющие на активацию/репрессию механизмов контроля определенных генетических групп иммунной системы, несущих ответственность за морфологическое и функциональное становление, а также за единство и эффективность процессов иммунологического надзора. С данной точки зрения наиболее важными в развитии иммунной системы человека являются внутриутробный и ранний постнатальный периоды.
У новорожденных иммунная система находится в процессе созревания и подготовки к новым условиям существования. При рождении человек подвергается воздействию окружающей среды и оказывается восприимчивыми к инфекциям. Согласно ежегодным оценкам, 40% из трех миллионов неонатальных смертей по всему миру происходят в результате инфецирования новорожденных. Материнские антитела, передаваемые ребенку через плаценту, способствуют его защите первые 6 месяцев жизни (Liu L, Johnson HL, 2012). На процесс формирования клеточного иммунитета новорожденных, который происходит в течение первых трех месяцев, влияет множество факторов (Hodgins DC, et al., 2012). За последние несколько десятилетий проведены обширные исследования развития иммунной защиты на первом этапе постнатального онтогенеза. Достижения в понимании механизмов неонатального иммунитета показывают, что как врожденные, так и адаптивные реакции зависят от количества предшественников лимфоцитов, дозы антигена и способу их воздействия (Basha Saleem, et al., 2014).
Тимус, селезенку и лимфатические узлы относят к органам кроветворения и иммунологической защиты, при этом вилочковую железу принято считать центральным, а остальные – периферическими иммунокомпетентными структурами организма. В железе образуются тимусзависимые лимфоциты, тогда как другие кроветворные органы заселяются клетками лимфоидного ряда, которые вскоре начинают активно размножаться и дифференцироваться. В связи со своей функцией, все органы иммунной системы обильно кровоснабжаются и несут в себе большое количество лимфатических и кровеносных сосудов (Simon A.K., et al., 2015).
Выбор маркеров для проведения исследования обусловлен их функцией – все маркеры, а именно CD34, KiSS1, KiSS1R, PrE2 и PrE2R являются сосудистыми факторами, оказывая влияние на состояние кровеносных сосудов, а также играют ту или иную роль в процессе развития исследуемых лимфоидных органов. Так, кисспептины и их рецепторы вовлечены в регуляцию сосудистого тонуса (Mead EJ, Maguire JJ, Kuc RE and Davenport AP, 2007), простагландины E2 и их рецепторы принимают участие в снижении артериального давления, обладая мощным сосудорасширяющим эффектом (Юдаев Н.А., 1976), а белок СD34 отвечает за большинство гемопоэтических реакций в красном костном мозге (Bhatia M, Wang JCY, et al., 1997).
В настоящее время благодаря методам флуоресцентной и отражательной конфокальной микроскопии (КЛСМ) стало возможным получение изображений очень высокого качества даже в случае толстых срезов, нефиксированных и малоокрашенных образцов. По сравнению с традиционной микроскопией данный метод делает возможным регулирование глубины поля, что исключает ухудшения изображения фоновыми засветками, обеспечивая получение более контрастных изображений с большим разрешением. Метод широко применяется в патоморфологии и в сочетании с иммуногистохимическим окрашиванием позволяет охарактеризовать отдельную клеточную популяцию или исследовать локализацию множества различных белковых молекул на ограниченном материале (Дурнова А.О., Крылова Ю.С., 2014).
Исходя из недостаточной изученности маркеров CD34, KiSS1, KiSS1R, PrE2 и PrE2R, и их динамики в иммуннокомпетентных органах в раннем постнатальном онтогенезе, целью нашей работы явилась оценка уровня экспрессии PrE2 и сосудистых факторов в тимусе, селезенке и лимфатических узлах человека на ранних стадиях постнатального развития.
Исходя из цели были поставлены следующие задачи:
Верифицировать и оценить уровень экспрессии PrE2, его рецептора - PrE2R и сосудистых факторов в тимусе, селезенке и лимфатических узлах человека на ранних стадиях постнатального онтогенеза;
Определить корреляцию между уровнем экспрессии указанных факторов и возрастом детей;
Проанализировать топографию областей, экспрессирующих изученные маркеры в структуре исследуемых лимфоидных органов;
Оценить степень функционального созревания основных органов иммунной системы (тимуса, селезенки, лимфатических узлов) человека в период раннего
Определить уровень экспрессии комплекса KISS1/KISS1R в органах лимфоидного ряда.
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Тимус (син. зобная/вилочковая железа) – центральный орган иммунной системы (рис.1). Ежедневно в тимусе синтезируется 5х107 новых клеток, часть из которых покидает железу в виде зрелых Т-лимфоцитов, поступая в кровь и расселяясь в лимфоидных органах. При этом каждый день в вилочковой железе погибает около 90% тимоцитов. Орган отвечает за формирование и функционирование клеточной системы иммунитета (Фрейдлин И.С., 1997).
Тимус представляет собой дольчатый инкапсулированный орган, который состоит из двух симметричных частей, соединенных между собой перешейком. Железа расположена близко к перикарду, на уровне нижней части щитовидной железы и выше, к четвертому реберному хрящу (Фрейдлин И.С., 1997; Shahid S., et al, 2016).
Рис.1 Строение дольки тимуса (Хаитов Р.М., 2009)
Вилочковая железа покрыта соединительнотканной капсулой, септы которой проникают в ткань органа и делят его на неполные дольки. Капсула состоит из внутреннего и наружного слоев коллагена и ретикулярных волокон, между которыми находятся лимфоциты. Каждая из долек имеет темную периферическую область, называемую кортексом и более светлую промежуточную зону - медуллу, или мозговое вещество тимуса. В основе дольки - рыхлая сеть из звездчатых эпителиальных клеток, петли которой инфильтрованы лимфоцитами. В железе отсутствуют зародышевые центры, характерные для селезенки и лимфатических узлов.
Кортекс (Сortex), или корковый слой - это внешняя часть вилочковой железы, которая содержит большое количество мелких плотно упакованных предшественников Т-лимфоцитов. Здесь проходят ранние стадии развития тимоцитов, содержатся эпителиальные ретикулярные клетки и макрофаги, а также осуществляется перегруппировка генов поверхностных рецепторов Т-клеток. Клетки тимуса, в особенности коркового вещества, отличаются гораздо более высокой митотической активностью, чем клетки других лимфоидных тканей (Пэттэн Б., 1959; Shahid S., et al, 2016).
По мере созревания тимоциты, притерпевая позитивную селекцию, продвигаются из кортекса вглубь железы, попадая в "мозговой" слой, где встречаются с другими клетками стромы. Такая область клеточного перемещения носит название кортико-медуллярного перехода, который характеризуется многочисленными кровеносными сосудами, малым количеством соединительной ткани и зрелых Т-лимфоцитов (Shahid S., et al, 2016).
Медулла, или мозговое вещество (Medulla) - это центральная часть органа, где располагается более плотная, по сравнению с корковым слоем, сеть ретикулярных эндотелиальных клеток, а лимфоидные клетки меньше по размеру. За счет небольшого числа лимфоцитов и превалирования сетевидной эпителиальной основы, данная область железы имеет более светлую окраску, чем зона кортекса. Здесь локализуется целый ряд концентрических тел, известных как карпускулы (corpuscles), или тельца Гассаля, которые представляют собой концентрические уплощенные ретикулярные клетки эпителия, заполненные кератиновыми нитями. Установлено, что образование гассалевых телец происходит в результате скопления уплощающихся эпителиальных клеток вокруг клетки, которая содержит секретоподобное вещество. В кортикальном слое тельца Гассаля отсутствуют (Пэттэн, 1959; Shahid S., et al, 2016). Также в мозговом веществе проходит последний этап развития тимоцитов (Shahid S., et al, 2016).
Таким образом медулла - область железы, в которой происходит подавляющая часть негативного отбора, в ходе которой дендритные и интердигитирующие клетки отбирают лимфоциты, которые способны к взаимодействию с антигенами собственного организма, и запускают их апоптоз (Shahid S., et al, 2016).
В тимусе содержатся многочисленные артерии, которые проходят вдоль междольковых септ и способны проникать внутрь органа. В кортексе железы артерии образуют ряд сложных сплетений, и в сочетании с сетчатыми эндотелиальными клетками, и белыми кровяными тельцами (макрофагами и лимфоцитами), образуют гематотимический барьер - физиологическое препятствие между кровеносной системой и тимусом, которое задерживает поступление в железу высокомолекулярных соединений из кортикальных капилляров, позволяя тимоцитам дифференцироваться при отсутствии контакта с чужеродными антигенами. У капилляров тимуса отсутствует толстая базальная пластинка и перфорированный эндотелий, что делает орган проницаемым для белков. Кровоснабжение осуществляется от внутренней грудной артерии, а также от верхней и нижней артерий щитовидной железы. Далее происходит дренаж в левую безымянную вену, а также верхнюю, среднюю и нижнюю вены щитовидной железы (D. Pinkel, 1968; Anagnostou V. et al, 2016; Shahid S., et al, 2016).
Иннервация тимуса минимальна и реализуется посредствам блуждающих нервов и симпатической нервной системы, через постганглионарные норадренергические волокона, уходящие вглубь органа (Anagnostou V. et al, 2016).
Формирование тимуса у млекопитающих происходит из третьих и/или четвертых пар глоточных карманов, в соответствии с чем орган носит название вилочковой железы III и IV. Первый тип является основным и имеется у большинства млекопитающих, тогда как второй тип может отсутствовать или же присутствовать в качестве рудиментарного образования.
На 6-й неделе внутриутробного развития человека появляются первые признаки формирования тимуса. В тесной связи с жаберными пластинками закладываются вентральные выросты третьей пары глоточных карманов. К началу 7-й недели зачаток вилочковой железы существенно удлиняется, но все еще сохраняет связь с глоточными карманами и с паращитовидными железами III, которые в течении недели теряют свои полости и быстро увеличиваются в объеме: зачатки смещаются к средней линии, начиная сближаться своими концами. На 8-й неделе внутриутробного развития все производные глотки смещаются в область шеи. Начинают контактировать дистальные концы зачатков тимуса, которые перемещаются к перикарду в область средостения (Пэттэн Б., 1959; Фрейдлин И.С.,1997).
В течение 3-го месяца эмбриональной жизни образуются тельца Гассаля, которые формируются из клеточных тяжей, заложенных на более ранних этапах развития. В первичных эпителиальных закладках начинаются регрессивные процессы. Параллельно происходит вторичное врастание мезенхимы, которая к концу месяца превращается в ретикулярную соединительную ткань, а мигрирующие в нее клетки преобразуются в лимфоциты. Благодаря быстрой пролиферации лимфобластов, численность белых кровяных телец стремительно возрастает. Таким образом, вскоре тимус по своему гистологическому строению становится больше похож на лимфоидный орган, чем на развивающуюся железу. На последних этапах своей дифференцировки вилочковая железа становится дольчатой. По причине только поверхностной интеграции зачатков, орган сохраняет подобное строение на протяжении всего онтогенеза, тогда как его дефинитивное положение непостоянно (Пэттэн Б., 1959; Hill, M.A., 2016; Фрейдлин И.С.,1997).
Соотношение между корковым и мозговым веществом в процессе постнатального онтогенеза, изменяется. Если к моменту рождения вилочковая железа характеризуется преобладанием кортекса над медуллой, то к старчеству корковое вещество практически исчезает (Фрейдлин И.С., 1997). Особенности гистологии, описанные для фетального тимуса, актуальны также и для железы молодых людей. По данным различных авторов, достоверное увеличение массы органа регистрируется в возрасте от 1 до 3 лет и составляет 15 г. В период с 3 до 20 лет отмечают стабилизацию веса тимуса и пик его массы – 37 г (рис.2). У людей старшего возраста и у стариков железа весит в среднем до 15 г (Liu D, Ellis H., 2016).
По окончании периода созревания лимфоидная ткань переживает так называемое жировое перерождение, в процессе которого происходит ее постепенная деградация с последующим замещением жировой тканью, и/или испытывает фиброзное перерождение, когда происходит ее замена на соединительную ткань. Тенденция органа к уменьшению в размерах у позвоночных известна как инволюции тимуса. К пятидесяти годам остается только около 15% тимуса; к семидесяти пяти годам вес железы среднего человека составляет всего 6 грамм. Тимус пожилых людей представлен жировой и индифферентной соединительной тканью, в которой заключены тельца Гассаля, окруженные небольшим количеством лимфоидной ткани (Пэттэн Б., 1959; Hill, M.A., 2016; Фрейдлин И.С.,1997).
Рис.2. Развитие тимуса в онтогенезе (Hill, M.A., 2016).
С возрастом необходимость в генерации новых Т-лимфоцитов отпадает, в связи с тем, что после создания пула периферических Т-лимфоцитов, утрата тимуса уже не приводит к катастрофическому снижению иммунитета. Инволюции тимуса не вызвана старением напрямую, поэтому анатомы затрудняются ответить на вопрос, почему именно деградирует железа. Согласно основной гипотезе, инволюции вилочковой железы является эволюционным компромиссом. Иммунная система дорого обходится организму в физиологическом плане, поэтому, сразу после вступления в период созревания, иммунитет перестает быть приоритетной задачей (Liu D, Ellis H., 2016).
Исследования Alberto Varas и др. показали, что уровень кортизола в сыворотке крови новорожденных доноров не увеличен, свидетельствуя о том, что неонатальная инволюция тимуса является физиологическим, а не стресс-ассоциированным патологическим событием, происходящим в перинатальный период (Varas A, Jime´nez E, Sacedo´n R. et al., 2000).
Отсутствие вилочковой железы у взрослых людей может быть причиной того, что заражение их “детскими” вирусами – возбудителями кори или ветрянки, приводит к развитию значительно более тяжелых, чреватых осложнениями заболеваний, по сравнению с подобными у детей. (Фрейдлин И.С., 1997; George A., Ritter M., 1996).
Показана обратная связь между размером фетального тимуса человека и количеством регуляторных Т - клеток в пуповинной крови (Anke D, Isabel H, et al, 2015). Размер вилочковой железы измерялся четырьмя различными методами ультразвуковых исследований. Подходы с самым низким коэффициентом вариации (измерение тимуса в поперечном диаметре и 3 крайних сосудов) были использованы для оценки размера плода и роста тимуса в 137 случаях, в четырех временных промежутках в период гестационного возраста (от 13 до 37 недель). Пуповинная кровь при рождении анализировалась методом проточной цитометрии для оценки количества регуляторных Т-клеток (Treg). Наблюдалась обратная корреляция между размером тимуса у плода на момент гестации в период с 23-25 неделю и количеством Т-клеток в пуповинной крови Treg (r = 0,37, р = 0,01). Рост тимуса происходит линейным способом в течение всей беременности и может быть надежно измерен с помощью ультразвука. Результаты, показавшие обратную корреляцию между ростом тимуса и количеством Treg-клеток в пуповинной крови, предполагают взаимосвязь между ростом плода, развитием тимуса и иммунным статусом при рождении (Anke D, Isabel H, et al, 2015).
|
